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第一篇 生化分离技术2

第一章 提取与沉淀分离技术2

第一节 细胞破碎2

一、机械破碎法2

二、物理破碎法3

三、化学破碎法4

四、酶促破碎法4

第二节 提取4

一、提取的方法5

二、影响提取的因素6

第三节 沉淀分离6

一、盐析沉淀法7

二、等电点沉淀法10

三、有机溶剂沉淀法10

四、复合沉淀法11

五、金属盐沉淀法11

六、选择性变性沉淀法12

第四节 实验12

实验1-1大肠杆菌细胞的超声波破碎12

实验1-2枯草杆菌碱性磷酸酶的提取与盐析13

实验1-3枯草杆菌DNA的提取与分离14

实验1-4酵母RNA的提取与分离15

实验1-5大蒜细胞SOD的提取与分离16

实验1-6大鼠肝rRNA的提取与分离17

第二章 过滤与膜分离技术19

第一节 非膜过滤19

一、非膜过滤的分类19

二、非膜过滤的操作过程20

第二节 膜分离技术20

一、膜分离的分类21

二、膜分离的操作过程及其控制22

第三节 实验23

实验2-1胰凝乳蛋白酶的透析脱盐23

实验2-2糖化酶的超滤分离24

第三章 萃取分离技术26

第一节 有机溶剂萃取26

一、有机溶剂的选择26

二、有机溶剂萃取的操作过程26

第二节 双水相萃取27

一、双水相萃取的原理27

二、双水相萃取的操作过程27

第三节 超临界萃取28

一、超临界萃取的原理29

二、超临界萃取的操作过程29

第四节 反胶束萃取31

一、反胶束萃取的原理31

二、反胶束萃取的操作过程31

第五节 实验32

实验3-1青蒿素的超临界萃取分离32

实验3-2人生长激素的双水相萃取分离33

实验3-3穿心莲内酯的有机溶剂萃取34

第四章 层析分离技术35

第一节 吸附层析35

一、吸附层析原理35

二、吸附柱层析36

三、聚酰胺薄膜层析39

四、其他吸附层析39

第二节 分配层析39

一、纸层析40

二、薄层层析43

三、气相层析45

第三节 离子交换层析52

一、离子交换剂的选择与处理53

二、离子交换层析的操作过程54

第四节 凝胶层析55

一、凝胶层析的基本原理55

二、凝胶的选择与处理57

三、凝胶层析操作过程58

第五节 亲和层析60

一、亲和层析母体和配基60

二、亲和层析方法61

第六节 层析聚焦62

一、交换剂和缓冲液体系63

二、pH梯度的形成63

三、层析聚焦的操作过程63

第七节 实验64

实验4-1蛋白质溶液的凝胶层析脱盐64

实验4-2氨基酸的纸层析64

实验4-3核苷酸的离子交换层析66

实验4-4胰蛋白酶的亲和层析68

实验4-5凝胶层析测定蛋白质的相对分子质量69

实验4-6 DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜层析70

实验4-7醇酯成分的气相层析72

实验4-8胆酸混合液的薄层层析74

第五章 电泳技术75

第一节 电泳的基本原理75

第二节 纸电泳76

一、缓冲液的选择76

二、滤纸的选择与剪裁76

三、电泳操作要点76

第三节 薄层电泳78

第四节 薄膜电泳78

第五节 凝胶电泳79

一、聚丙烯酰胺凝胶的制备原理79

二、不连续电泳中样品压缩成层的原理80

三、SDS-凝胶电泳原理81

四、凝胶电泳的操作要点81

第六节 等电点聚焦电泳82

一、稳定pH梯度的形成83

二、两性电解质载体83

三、支持pH梯度的介质83

四、等电点聚焦电泳的操作要点84

第七节 实验85

实验5-1核苷酸的纸电泳85

实验5-2蛋白质的醋酸纤维薄膜电泳86

实验5-3 DNA的琼脂糖凝胶电泳87

实验5-4蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳88

实验5-5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量90

实验5-6蛋白质的二元凝胶电泳91

第六章 离心分离技术94

第一节 离心机的选择94

一、常速离心机94

二、高速离心机94

三、超速离心机94

第二节 离心方法的选择95

一、差速离心95

二、密度梯度离心96

三、等密度梯度离心97

第三节 离心条件的确定98

一、离心力98

二、离心时间98

三、温度99

四、pH99

第四节 实验99

实验6-1细菌核糖体的分离99

实验6-2大肠杆菌细胞膜的分离100

实验6-3 RNA的蔗糖密度梯度离心分离101

实验6-4 大鼠肝细胞核的分离102

第二篇 生化检测技术104

第七章 化学检测技术104

第一节 糖类的化学检测104

一、蓝-爱农法104

二、斐林试剂快速法105

三、次碘酸钠法106

四、铜试剂法107

第二节 蛋白质和氨基酸的化学检测108

一、定氮法测定蛋白质的含量108

二、双缩脲试剂法测定蛋白质含量109

三、福林-酚试剂法测定蛋白质含量109

四、蛋白质N端氨基酸丹磺酰化测定法110

五、蛋白质的氨基酸排列顺序测定——埃德曼分析法111

六、蛋白质N端氨基酸2，4-二硝基氟苯测定法113

七、茚三酮显色法测定氨基酸含量115

八、甲醛滴定法测定氨基酸116

第三节 蛋白质的免疫化学检测116

一、基本概念与原理116

二、蛋白质的免疫化学检测方法117

第四节 核酸的化学检测118

一、定磷法测定核酸含量118

二、二苯胺法测定DNA含量119

三、地衣酚法测定RNA含量119

第五节 实验120

实验7-1斐林试剂置换法测定还原糖120

实验7-2葡萄糖淀粉酶的活力测定121

实验7-3微量凯氏定氮法测定总氮量122

实验7-4福林-酚试剂法测定蛋白质含量124

实验7-5丹磺酰化法分析蛋白质N端氨基酸124

实验7-6异硫氰酸苯酯分析法测定肽链的氨基酸排列次序125

实验7-7茚三酮显色法测定氨基酸含量127

实验7-8双向免疫扩散法测定抗血清效价128

实验7-9定磷法测定核酸含量129

实验7-10地衣酚显色法测定核糖核酸（RNA）含量130

实验7-11二苯胺显色法测定DNA含量131

第八章 光学检测技术132

第一节 旋光检测技术132

一、原理132

二、操作要点133

第二节 荧光检测技术133

一、邻苯二甲醛荧光分析法测定氨基酸133

二、荧光胺荧光分析法测定肽含量134

第三节 分光光度检测技术135

一、原理135

二、操作要点136

第四节 实验137

实验8-1旋光法测定味精的纯度137

实验8-2荧光法测定核黄素含量138

实验8-3荧光法测定氨基酸含量139

实验8-4紫外线吸收法测定核酸含量139

实验8-5紫外线吸收法测定蛋白质含量140

第九章 酶学检测技术141

第一节 酶学检测技术的特点141

一、酶学检测的专一性强141

二、酶学检测的灵敏度高141

三、酶学检测的速度快141

四、酶学检测的条件温和141

第二节 酶法分析技术142

一、酶法分析的基本过程142

二、常用于酶法分析的酶及其检测方法142

第三节 酶联免疫吸附检测技术144

一、ELISA的基本原理144

二、ELISA常用的标记酶144

三、常用的ELISA方法146

四、ELISA技术的应用147

第四节 实验148

实验9-1利用酶法分析测定鸡蛋中总胆固醇的含量148

实验9-2利用酶法分析快速测定发酵液中的L-乳酸149

实验9-3利用酶法分析测定发酵液中葡萄糖的浓度151

实验9-4酶联免疫吸附检测法（双抗体夹心法）检测艰难梭菌毒素152

实验9-5酶联免疫吸附检测法（间接法）测定兔血清免疫球蛋白IgG153

第十章 气体检测技术155

第一节 华勃氏呼吸仪检压法156

第二节 范·斯莱克检测仪测定α-氨基酸含量158

第三节 实验158

实验10-1酵母细胞耗氧量的测定158

实验10-2华勃氏呼吸仪测定L-谷氨酸脱羧酶活力159

实验10-3华勃氏呼吸仪测定L-谷氨酸含量160

第十一章 生物检测技术162

第一节 安全性试验162

一、毒性试验162

二、局部刺激性试验163

三、溶血试验163

四、热原试验163

五、过敏试验164

第二节 生长抑制物质的生物效价测定164

一、稀释法165

二、扩散法165

第三节 生长促进物质的生物效价检测167

一、稀释法167

二、扩散法167

三、比浊法167

四、滴定法167

第四节 实验168

实验11-1卡那霉素的效价测定168

实验11-2二环素的杀菌能力测定169

实验11-3细胞病变抑制法测定于犹素的效价170

实验11-4热原试验171

第十二章 放射性同位素检测技术173

第一节 基本知识173

一、放射性同位素173

二、放射性同位素的衰变与射线173

三、衰变规律174

四、放射线的防护174

第二节 放射性同位素的检测175

一、放射自显影技术175

二、盖革计数管探测176

三、闪烁计数器探测177

第三节 放射性同位素的掺入177

第四节 实验178

实验12-1 γ-32P-ATP的酶促合成178

实验12-2 3H-蛋白质的生物合成179

实验12-3 3H-蛋白质凝胶的放射荧光显影179

第三篇 酶、基因和细胞操作技术182

第十三章 酶操作技术182

第一节 酶生物合成的调节技术182

一、酶的诱导合成182

二、酶生物合成的阻遏184

第二节 酶反应动力学的研究技术185

一、酶反应初速率的测定185

二、底物浓度对反应速率的影响——Km和v max的测定185

三、最适温度、热稳定性和活化能的测定187

四、最适pH的测定188

五、酶的激活与抑制188

第三节 酶、细胞和原生质体固定化技术189

一、吸附法固定化技术189

二、包埋法固定化技术190

三、结合法固定化技术191

四、交联固定化技术192

第四节 酶分子修饰技术193

一、金属离子置换修饰193

二、大分子结合修饰193

三、酶的侧链基团修饰194

四、肽链有限水解修饰196

五、核苷酸链的剪切修饰197

六、氨基酸置换修饰197

七、核苷酸置换修饰198

八、酶分子的物理修饰198

第五节 酶分子定向进化技术199

一、基因体外随机突变技术199

二、突变基因的高通量筛选技术201

第六节 实验204

实验13-1 β-半乳糖苷酶的诱导合成204

实验13-2无机磷酸对枯草杆菌碱性磷酸酶生物合成的阻遏作用205

实验13-3碱性磷酸酶的反应动力学性质206

实验13-4 L-谷氨酸脱羧酶的固定化208

实验13-5枯草杆菌细胞固定化209

实验13-6谷氨酸棒杆菌原生质体固定化209

实验13-7固定化原生质体生产谷氨酸脱氢酶210

实验13-8采用易错PCR技术提高扁桃酸酯酶的立体选择性211

实验13-9利用DNA重排技术提高β-甘露聚糖酶的温度耐受性213

第十四章 基因操作技术216

第一节 基因的获取技术216

一、分离法216

二、反转录法217

三、化学合成法218

四、聚合酶链反应技术219

第二节 载体的制备技术221

一、载体的分类221

二、载体的制备221

第三节 DNA体外重组技术223

一、黏性末端连接223

二、平头末端连接224

三、修饰末端连接225

第四节 重组DNA引入受体细胞技术225

一、受体细胞的筛选与处理225

二、外源DNA引入受体细胞226

第五节 重组DNA的鉴定技术227

一、DNA印迹技术227

二、RNA印迹技术228

三、蛋白质印迹技术228

四、DNA序列测定技术229

第六节 实验232

实验14-1大肠杆菌ColE Ⅰ质粒的分离232

实验14-2重组DNA的细胞转化233

实验14-3 Sanger测序法测定基因的序列234

实验14-4 DNA印迹杂交235

实验14-5 PCR扩增目的基因236

实验14-6碱裂解法提取质粒DNA237

第十五章 细胞操作技术239

第一节 动物细胞融合技术239

一、细胞的制备239

二、细胞融合240

三、融合子的筛选240

第二节 原生质体融合技术241

一、原生质体制备241

二、原生质体融合244

三、细胞壁的再生245

四、融合子的筛选245

第三节 细胞拆合技术246

一、细胞器的分离246

二、细胞器重组247

第四节 实验248

实验15-1枯草杆菌原生质体的制备248

实验15-2酵母原生质体的分离与再生249

实验15-3从胡萝卜细胞分离原生质体250

实验15-4动物细胞微核体和胞质体的制备250

主要参考文献252

附录253