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第一章 显微技术1

第一节 显微观察1

一、相差显微镜1

实验1-1相差显微镜的使用1

二、荧光显微镜3

实验1-2荧光显微镜的使用5

三、电子显微镜7

实验1-3细菌、酵母菌超薄切片的透射电镜观察8

实验1-4噬菌体的透射电镜观察10

实验1-5质粒DNA的透射电镜观察10

实验1-6酵母细胞的扫描电镜观察13

第二节 显微摄影14

实验1-7显微摄影、菌落摄影和凝胶摄影15

第三节 放射自显影18

实验1-8硝酸纤维素滤纸上标记DNA的放射自显影18

第四节 显微操作技术用于单细胞分离19

实验1-9显微操纵器用于单细胞分离20

实验1-10显微操纵器用于酵母子囊的解剖及子囊孢子单孢化21

实验1-11玻璃微型工具的制作22

第五节 流式细胞仪测定细胞核内DNA的含量23

实验1-12流式细胞仪计数法24

第二章 微生物细胞特殊结构的观察25

第一节 染色技术25

一、染色的基本原理25

二、染料25

三、染色26

实验2-1真菌的荧光染色与观察26

第二节 细胞主要结构成分的分离与观察28

实验2-2革兰阳性细菌细胞壁的制备29

实验2-3酵母细胞壁甘露聚糖的制备30

实验2-4细胞壁的形态观察31

实验2-5革兰阴性菌细胞外膜蛋白的分离32

实验2-6细菌荚膜的观察33

实验2-7细菌鞭毛的观察33

实验2-8微生物细胞核的观察35

实验2-9细菌染色体DNA的分离与观察36

实验2-10异染颗粒的观察37

实验2-11酵母细胞内脂肪颗粒和肝糖颗粒的观察38

实验2-12酵母液泡及线粒体的提取39

第三节 芽孢、子囊孢子和假菌丝的观察42

一、芽孢42

实验2-13细菌芽孢形成及发芽的观察44

实验2-14伴孢晶体的观察44

二、酵母子囊孢子45

实验2-15酵母子囊孢子的形成及观察45

实验2-16酿酒酵母单倍体细胞的制备与鉴定46

三、流式细胞术47

实验2-17酿酒酵母染色体倍性鉴定48

四、酵母假菌丝48

实验2-18酵母假菌丝的观察49

第三章 噬菌体50

实验3-1噬菌体的分离与纯化52

实验3-2高效价噬菌体原液的制备53

实验3-3溶源菌的鉴定54

实验3-4抗噬菌体产α-淀粉酶菌株的选育55

第四章 标记菌种的获得与应用56

第一节 富集培养技术在获得标记菌种中的应用56

一、营养缺陷型富集法在原核细胞中的应用56

实验4-1芽孢杆菌营养缺陷型的筛选56

二、营养缺陷型富集法在真核细胞中的应用58

实验4-2酵母营养缺陷型的筛选59

实验4-3青霉菌营养缺陷型菌株的筛选59

三、浓度梯度法富集抗性突变株60

四、富集法在研究次级代谢的重组DNA技术中的应用61

第二节 营养缺陷型标记菌种的获得62

一、诱变方法62

二、淘汰野生型62

三、检出缺陷型62

四、营养缺陷型生长谱的确定63

实验4-4芽孢杆菌营养缺陷型生长谱的确定65

第三节 呼吸缺陷型标记菌种的获得66

实验4-5酵母呼吸缺陷型的筛选67

第四节 抗反馈调节抗性突变株的获得与应用67

实验4-6氨基酸抗反馈调节突变株的选育69

第五章 原生质体系列育种技术71

第一节 工业菌种育种的策略71

第二节 原生质体融合育种72

一、原生质体融合育种的特点72

二、原生质体融合育种步骤与要点74

三、原生质体再生率和融合率的计算77

实验5-1芽孢杆菌的原生质体融合77

实验5-2链霉菌原生质体融合78

实验5-3小单胞菌的原生质体融合80

实验5-4酿酒酵母的原生质体融合81

实验5-5丝状真菌的原生质体融合82

第三节 原生质体转化育种85

实验5-6芽孢杆菌原生质体转化86

实验5-7质粒DNA转化链霉菌原生质体86

实验5-8酿酒酵母的原生质体转化法87

实验5-9真菌原生质体转化88

第四节 原生质体诱变育种90

实验5-10芽孢杆菌种间融合子F-26-2原生质体诱变育种90

实验5-11紫外线诱变原生质体选育L谷氨酸高产菌90

第五节 原生质体技术中的一些特殊技术92

一、紫外线照射原生质体增加融合率92

二、供体原生质体的热灭活92

三、原生质体电融合技术93

实验5-12电诱导酵母原生质体融合93

四、遗传转移93

实验5-13原生质体融合法转移酵母线粒体及杀伤质粒94

第六章 基因工程育种技术96

第一节 基因工程的基本过程和原理96

一、载体96

二、DNA重组用酶98

第二节 大肠杆菌基因工程102

一、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化102

实验6-1用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌103

实验6-2用氯化钙制备感受态大肠杆菌104

实验6-3用PEG制备和转化大肠杆菌感受态细胞104

实验6-4大肠杆菌的电击转化105

二、大肠杆菌中质粒的提取与纯化106

实验6-5质粒的大量提取与纯化106

实验6-6质粒的小量提取107

实验6-7用硅胶膜分离法小量提取质粒108

三、外源基因在大肠杆菌中的高表达109

实验6-8载体和基因的酶切111

实验6-9基因与载体的连接112

第三节 非大肠杆菌微生物基因工程115

一、芽孢杆菌基因工程115

实验6-10枯草杆菌感受态细胞的制备和转化117

实验6-11枯草杆菌染色体DNA的提取117

实验6-12枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）碱性果胶酶基因的PCR扩增118

实验6-13从电泳凝胶中分离枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）碱性果胶酶基因119

实验6-14枯草杆菌转化子质粒的提取和检测119

实验6-15地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化120

二、酵母基因工程121

实验6-16酵母染色体DNA的提取122

实验6-17酿酒酵母的乙酸锂完整细胞转化法123

实验6-18单链载体DNA的制备124

实验6-19酵母菌质粒DNA的提取124

实验6-20碱性果胶酶基因重组巴斯德毕赤酵母的构建125

实验6-21羟酸还原异构酶基因多拷贝重组啤酒酵母的构建129

第四节 其他基因工程育种常用技术130

实验6-22酿酒酵母W303甘油酯酶GPP2基因敲除技术130

实验6-23粗糙脉孢菌漆酶基因的定点突变技术131

第五节 蛋白质纯化技术133

实验6-24利用His标签进行Ni柱纯化甘油脱氢酶的分离技术133

实验6-25离子交换色谱技术分离纯化蛋白质135

第七章 微生物细胞固定化方法137

第一节 载体结合法137

一、表面吸附法138

二、共价结合法138

实验7-1 Amycolatopsis sp.ST2710的载体固定化138

第二节 交联法139

第三节 包埋法140

一、藻酸钙凝胶包埋法140

实验7-2酿酒酵母的藻酸钙固定化141

实验7-3固定化枯草杆菌连续生产耐热α-淀粉酶143

二、к-角叉胶包埋法143

实验7-4к-角叉胶一步包埋法144

实验7-5к-角叉胶二步包埋法145

实验7-6固定化酵母连续生产酒精146

实验7-7固定化细胞的回收与活细胞计数146

三、聚丙烯酰胺凝胶包埋法147

实验7-8大肠杆菌的聚丙烯酰胺凝胶固定化147

四、光交联树脂前聚体包埋法148

实验7-9光交联树脂固定化原生质体148

第八章 菌种保藏方法与机构149

第一节 菌种的退化与防治措施149

一、菌种退化的现象及原因149

二、防止退化措施150

第二节 常用菌种保藏151

一、菌种保藏的原理151

二、常用的菌种保藏方法151

实验8-1斜面保藏法151

实验8-2液体石蜡保藏法152

实验8-3载体保藏法152

实验8-4甘油管低温保藏法154

实验8-5液氮冷冻保藏法154

实验8-6真空冷冻干燥保藏法156

第三节 基因工程菌的保藏157

第四节 著名菌种保藏及专利菌种保藏机构158

一、中国微生物菌种保藏管理委员会组织系统158

二、国际著名菌种保藏机构159

三、国际确认的专利菌种保藏机构（IDA）167

参考文献169