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目录1

前言1

第一章 绪论1

第一节 基因工程的概念1

第二节 基因工程的诞生与发展2

一、基因工程诞生的理论基础2

二、基因工程的诞生3

三、基因工程的发展4

第三节 基因工程研究的主要内容5

一、基因工程研究的主要内容5

二、基因工程的基本操作程序7

三、基因工程的基本操作内容7

第四节 基因工程的意义与发展前景8

一、基因工程研究的意义8

二、基因工程发展前景8

本章小结8

思考题9

第二章 基因工程工具酶10

第一节 限制性核酸内切酶10

一、宿主的限制和修饰现象10

二、限制性核酸内切酶的类型11

三、限制性核酸内切酶的命名12

四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性13

五、Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件17

六、影响限制性核酸内切酶活性的因素18

第二节 DNA连接酶20

一、概念与机理20

二、DNA连接酶的种类22

三、DNA连接酶的反应体系23

四、影响连接反应的因素23

第三节 DNA聚合酶24

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ25

二、Klenow片段26

三、T4噬菌体DNA聚合酶27

四、T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶28

五、Taq DNA聚合酶28

六、逆转录酶29

第四节 末端脱氧核苷酸转移酶29

第五节 核酸酶30

一、核糖核酸酶30

二、脱氧核糖核酸酶Ⅰ32

三、S1核酸酶32

第六节 核酸外切酶33

一、大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ34

二、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ34

三、Bal 31核酸酶35

第七节 T4噬菌体多核苷酸激酶35

一、T4噬菌体多核苷酸激酶的性质35

二、多核苷酸激酶的用途37

第八节 碱性磷酸酶37

一、碱性磷酸酶的性质37

二、碱性磷酸酶的用途37

本章小结38

思考题40

第三章 基因工程载体41

第一节 质粒载体41

一、质粒的一般生物学特性41

二、理想质粒载体的必备条件44

三、质粒载体的构建45

四、常用的质粒载体类型48

第二节 λ噬菌体载体52

一、λ噬菌体的生物学特性52

二、λ噬菌体载体的构建53

三、常用的λ噬菌体载体55

第三节 单链DNA噬菌体载体57

一、M13噬菌体的生物学特性57

二、M13噬菌体载体的构建58

三、M13噬菌体载体的主要用途59

四、噬菌粒载体60

第四节 黏粒载体60

一、黏粒载体的基本特点61

二、黏粒载体的构建62

三、黏粒载体在基因克隆中的应用62

四、常用的黏粒载体及应用63

第五节 其他载体64

一、人工染色体64

二、植物基因工程载体65

三、动物基因工程载体68

第六节 表达载体74

一、表达载体构建的一般原则74

二、植物表达载体77

本章小结82

思考题83

第四章 核酸操作的基本技术84

第一节 核酸的提取与纯化84

一、基本原理84

二、微生物DNA的提取86

三、动物细胞DNA的提取88

四、植物细胞核DNA的提取90

五、核外DNA的提取92

六、RNA的提取94

第二节 核酸的检测与保存97

一、核酸的检测97

二、核酸的保存100

第三节 核酸的凝胶电泳101

一、琼脂糖凝胶电泳101

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳103

三、脉冲电场凝胶电泳104

第四节 核酸分子杂交104

一、探针的制备105

二、核酸杂交106

本章小结109

思考题109

第五章 聚合酶链式反应110

第一节 聚合酶链式反应扩增原理110

第二节 聚合酶链式反应体系112

一、聚合酶链式反应操作程序112

二、聚合酶链式反应的成分112

三、聚合酶链式反应的条件114

第三节 聚合酶链式反应引物设计原则115

一、引物设计的一般原则116

二、引物3＇端的末位碱基116

三、引物设计软件116

第四节 聚合酶链式反应技术类型118

一、已知DNA序列的聚合酶链式反应扩增118

二、逆转录聚合酶链式反应120

三、已知cDNA一端序列获得全长cDNA的聚合酶链式反应121

四、已知侧翼序列聚合酶链式反应扩增123

五、未知序列聚合酶链式反应扩增125

六、定量聚合酶链式反应128

七、免疫相关聚合酶链式反应128

八、聚合酶链式反应技术衍生的分子标记129

第五节 聚合酶链式反应技术应用129

一、核酸的基础研究130

二、序列分析130

三、检测基因表达130

四、从cDNA库中放大特定序列131

五、研究已知片段邻近基因或未知DNA片段131

六、进化分析131

七、医学应用131

八、分析生物学证据132

九、性别控制132

十、转基因检测132

本章小结133

思考题133

第六章 基因文库的构建与目的基因的获得134

第一节 真核基因组DNA文库的构建134

一、用于构建基因组文库的载体134

二、基因组DNA克隆片段的制备137

三、重组DNA分子的构建138

四、重组DNA分子导入受体细胞139

五、基因文库的大小及代表性140

六、基因文库的扩增、分装及保存140

第二节 cDNA文库的构建141

一、mRNA的提取及其完整性的确定141

二、cDNA克隆载体的选择143

三、cDNA克隆片段的获得143

四、cDNA克隆的操作流程147

五、cDNA克隆片段的分析148

六、完整cDNA文库的生成148

七、cDNA文库的扩增、分装及保存148

第三节 目的基因的获得149

一、对已知序列基因的分离149

二、对未知序列基因的分离151

三、基因的人工合成153

本章小结153

思考题154

第七章 DNA体外重组与基因转移155

第一节 重组DNA分子的构建155

一、重组DNA的概念155

二、载体DNA与外源基因片段的连接156

第二节 基因转移162

一、重组DNA向细菌细胞转入163

二、外源目的基因向真核细胞转入164

本章小结166

思考题166

第八章 重组子的筛选与鉴定167

第一节 遗传学检测法168

一、根据载体表型特征的筛选168

二、根据插入基因遗传性状的筛选169

第二节 核酸分子杂交检测法170

一、菌落印迹原位杂交170

二、斑点印迹杂交170

三、Souithern印迹杂交171

第三节 物理检测法171

一、直接凝胶电泳检测法171

二、限制性核酸内切酶酶切片段分析法172

第四节 免疫化学检测法172

一、放射性抗体检测法173

二、免疫沉淀检测法173

三、Western印迹分析法174

第五节 核酸序列分析及其他方法174

一、核酸序列分析174

二、PCR法174

三、Northern印迹分析174

本章小结175

思考题175

第九章 外源基因的表达176

第一节 外源基因在大肠杆菌中的表达176

一、正确表达的基本条件177

二、常用的大肠杆菌表达载体177

三、外源蛋白质表达部位183

四、提高外源基因表达效率的方法184

五、表达产物的检测188

六、表达实例：人生长素基因在大肠杆菌中的表达188

第二节 真核细胞表达系统概述191

一、酵母表达体系191

二、昆虫细胞表达体系192

三、哺乳动物细胞表达体系193

本章小结194

思考题194

第十章 微生物基因工程195

第一节 细菌基因工程195

一、实现外源基因表达的基本操作196

二、大肠杆菌工程菌的构建策略198

三、基因工程菌遗传不稳定性及其对策208

四、细菌表达异源蛋白的流程211

第二节 酵母菌基因工程212

一、酵母菌宿主系统212

二、酵母菌的载体系统214

三、酵母菌的转化系统218

四、酵母菌的表达系统218

五、酵母菌的蛋白修饰分泌系统220

第三节 其他微生物系统在基因工程中的利用222

一、芽孢杆菌在基因工程中的应用223

二、棒状杆菌在基因工程中的应用226

三、假单胞杆菌在基因工程中的应用226

四、链霉菌在基因工程中的应用226

第四节 微生物基因工程的应用227

一、重组微生物工程菌与人类药物生产227

二、重组微生物工程菌与疫苗生产231

三、重组微生物工程菌与食品、饲料工业234

四、重组微生物工程菌与环境保护238

五、重组微生物工程菌与农业生产240

本章小结245

思考题246

第十一章 植物基因工程248

第一节 农杆菌及其转化体系248

一、根癌农杆菌的生物学特征248

二、Ti质粒的结构和功能249

三、Ti质粒的转化机理250

四、Ti质粒载体的改造与表达载体的构建253

五、Ri质粒载体系统256

第二节 目的基因的导入256

一、植物转化的受体系统及其考虑因素257

二、基因的导入方法258

第三节 外源基因的表达、检测与遗传特性264

一、转基因植物外源基因的表达及其调控264

二、外源基因的检测267

三、转基因植物的遗传特性269

第四节 植物基因工程的应用270

一、植物基因工程在植物分子生物学研究中的应用270

二、改良植物品种273

三、转基因植物作为生物反应器277

本章小结281

思考题282

第十二章 动物基因工程284

第一节 动物基因工程的概念与发展284

第二节 动物目的基因的选择与表达载体的构建285

一、动物转基因操作的一般程序285

二、目的基因的选择286

三、表达载体的构建287

四、外源基因的组织特异性表达293

第三节 基因导入的方法293

一、DEAE-葡聚糖转染法293

二、显微注射法294

三、病毒转染法295

四、胚胎干细胞介导法296

五、精子载体法297

六、基因同源重组法297

第四节 转基因动物的鉴定299

一、DNA水平的检测299

二、RNA水平的检测300

三、目的蛋白的检测301

第五节 动物基因工程技术的应用301

一、动物基因工程技术的应用301

二、动物转基因技术存在的问题307

三、提高转基因动物外源基因表达水平的方法与途径308

四、转基因动物的应用前景311

第六节 基因诊断311

一、基因诊断的基本方法312

二、基因芯片与疾病诊断313

第七节 基因治疗314

一、基因治疗概述314

二、基因治疗的方式315

三、基因治疗的前景318

本章小结318

思考题319

第十三章 分子标记及基因芯片技术与应用320

第一节 分子标记技术和应用320

一、分子标记的概念320

二、分子标记的类型321

三、标记系统在应用时的选择331

四、分子标记的应用334

第二节 基因芯片技术和应用336

一、概念336

二、基因芯片类型337

三、基因芯片的实验操作338

四、基因芯片的应用339

五、使用基因芯片时应注意的问题340

本章小结342

思考题342

第十四章 差异显示技术及其应用343

第一节 mRNA差异显示技术343

一、mRNA差异显示的基本原理343

二、mRNA差异显示实验的基本过程344

三、差异显示方法的优缺点345

四、差异显示的应用345

第二节 扣除杂交技术346

第三节 代表性差异分析技术349

一、代表性差异分析技术原理350

二、代表性差异分析技术主要步骤350

三、代表性差异分析技术的优缺点350

第四节 抑制性衰减杂交技术350

一、原理350

二、抑制性衰减杂交操作程序352

三、抑制性衰减杂交的优缺点353

第五节 基因表达系列分析353

一、基本原理353

二、操作步骤354

三、基因表达系列分析的优缺点355

第六节 差异显示技术的应用355

一、分析基因表达差异355

二、寻找遗传标记355

三、绘制染色体表达图谱356

四、分离特异表达的基因356

五、检查cDNA文库的质量356

六、鉴定种属特异性356

七、临床诊断遗传疾病357

本章小结357

思考题357

第十五章 生物信息学358

第一节 生物信息学概论358

一、蛋白质和核酸序列的测定358

二、生物大分子空间结构的测定359

三、生物学信息的迅猛增长359

四、生物信息学的基本概念及研究内容360

五、生物信息学研究的热点领域361

第二节 生物信息数据库363

一、核酸序列数据库363

二、蛋白质序列数据库369

三、大分子空间结构数据库373

四、基因组数据库376

第三节 数据的查询和提交377

一、Entrez查询系统377

二、SRS数据库查询系统379

三、数据提交384

第四节 序列比对和数据库搜索384

一、序列比对原理384

二、Blast387

第五节 多序列比对及系统发育分析389

一、多序列比对分析389

二、系统发育分析390

本章小结394

思考题394

第十六章 基因工程规则、专利及安全性395

第一节 基因工程研究实验室安全性基本要求395

第二节 基因工程产品的释放规则及要求396

一、基因工程药物投放的规则和要求396

二、转基因植物品种的释放要求397

三、ISO认证398

第三节 现代生物技术专利399

一、专利申请的要求400

二、现代生物技术专利类型401

三、专利的地域性401

四、专利与基础研究402

第四节 现代生物技术的社会伦理问题402

第五节 基因工程产品的安全性问题403

一、环境安全性403

二、转基因食品安全性404

本章小结405

思考题406

主要参考文献407