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第1章 大肠杆菌、质粒和噬菌体1

1.1培养基的制备及细菌学工具2

1.1.1极限培养基2

1.1.2丰富培养基2

1.1.3固体培养基3

1.1.4实验工具5

1.2在液体培养基中培养5

1.2.1基本方案1过夜培养5

1.2.2基本方案2大体积培养6

1.2.3基本方案3利用计数板监测生长情况6

1.2.4基本方案4利用分光光度计监测生长情况6

1.3固体培养基上培养7

1.3.1基本方案1通过连续稀释法滴定和分离细菌菌落7

1.3.2基本方案2通过平板划线法分离单菌落7

1.3.3基本方案3通过铺平板分离单个菌落7

1.3.4基本方案4影印平板7

1.3.5辅助方案 菌株的保存和复苏8

1.4经典细菌遗传学选论8

1.5质粒载体13

质粒载体的选择13

1.6质粒DNA的小量制备20

1.6.1基本方案1碱裂解小量制备20

1.6.2备选方案96孔微量滴定板碱裂解法21

1.6.3基本方案2煮沸小量制备法22

1.7质粒DNA的大量制备22

1.7.1基本方案1碱裂解法制备粗制裂解物22

1.7.2基本方案2氯化铯／溴化乙锭平衡离心法24

1.7.3备择方案 利用阴离子交换层析或分子筛层析纯化质粒DNA25

1.8将质粒DNA导入细菌细胞26

1.8.1基本方案1 CaCl2转化法26

1.8.2备择方案 一步法制备和转化感受态细菌27

1.8.3基本方案2高效率的电转化方法27

1.9λ噬菌体概述29

1.9.1裂解性生长29

1.9.2溶源性生长30

1.10作为克隆载体的λ噬菌体32

1.10.1用λ噬菌体的优点32

1.10.2选择插入的DNA32

1.10.3λ噬菌体来源的克隆载体的图谱35

1.11λ噬菌体铺平板产生噬斑35

1.11.1基本方案1通过连续稀释法分离单个噬斑35

1.11.2基本方案2噬菌体转染和体外包装构建36

1.12培养λ衍生的噬菌体载体37

1.12.1基本方案 通过平板裂解制备噬菌体库37

1.12.2备择方案 制备液体裂解物38

1.13从噬菌体裂解液中制备λDNA38

基本方案 通过分级平衡梯度离心制备DNA38

1.14源于丝状噬菌体的载体40

1.15利用M13噬菌体衍生载体制备单链DNA43

基本方案 利用辅助噬菌体从质粒制备单链DNA43

第2章 DNA的制备和分析45

电泳及其应用45

凝胶和电路46

2.1水溶液中DNA的纯化和浓缩46

2.1.1基本方案DNA的酚抽提和乙醇沉淀47

2.1.2备择方案1异丙醇沉淀DNA47

2.1.3辅助方案1丁醇浓缩DNA48

2.1.4辅助方案2醚抽提法去除残存酚、氯仿或丁醇48

2.1.5备择方案2硅膜离心柱法纯化DNA49

2.1.6备择方案3RNA及DNA稀溶液的纯化和浓缩49

2.1.7备择方案4乙醇沉淀法去除低分子质量的寡核苷酸和核苷三磷酸50

2.2阴离子交换色谱法纯化DNA50

基本方案50

2.3从哺乳动物组织中制备基因组DNA52

基本方案52

2.4从植物组织中制备基因组DNA53

2.4.1基本方案 氯化铯离心法制备植物DNA53

2.4.2备择方案CTAB制备植物DNA54

2.5从细菌中制备基因组DNA55

2.5.1基本方案 细菌基因组DNA的小量制备55

2.5.2备择方案 氯化铯法大规模制备细菌基因组DNA56

2.5.3辅助方案 从所得到的DNA制备物中除去多糖57

2.6琼脂糖凝胶电泳57

2.6.1基本方案DNA片段在标准琼脂糖凝胶上的分离57

2.6.2辅助方案 微型凝胶及中型凝胶58

2.7脉冲场凝胶电泳59

2.7.1基本方案 倒转电场凝胶电泳59

2.7.2备择方案 钳位均匀电场电泳（CHEF电泳）60

2.7.3辅助方案 高分子质量DNA样品和分子质量标准物的制备61

2.8从琼脂糖凝胶中分离和纯化大的DNA限制酶切片段62

2.8.1基本方案1琼脂糖凝胶电洗脱62

2.8.2基本方案2 NA-45纸电泳63

2.8.3基本方案3低熔点琼脂糖凝胶分离DNA64

2.8.4备择方案1β-琼脂糖酶消化法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA65

2.8.5备择方案2硅膜离心柱从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA65

2.8.6辅助方案 溴化乙锭斑点定量法对DNA浓度进行快速估测66

2.9常规凝胶电泳分离小分子DNA片段67

2.9.1基本方案1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳67

2.9.2备择方案 聚丙烯酰胺凝胶DNA小片段的电洗脱68

2.9.3基本方案2筛分型琼脂糖凝胶电泳69

2.10DNA的毛细管电泳69

2.10.1基本方案1寡核苷酸的分离72

2.10.2基本方案2定量PCR分析73

2.10.3备择方案 基因型分析75

2.11Southern印迹法75

2.11.1基本方案 用高盐缓冲液在尼龙膜或硝酸纤维素膜上进行Southern印迹75

2.11.2辅助方案 紫外透射仪的校准78

2.11.3备择方案1用碱性缓冲液在尼龙膜上进行Southern印迹78

2.11.4备择方案2用向下毛细管转移法进行Southern印迹79

2.11.5备择方案3从聚丙烯酰胺凝胶至尼龙膜的电转印法79

2.12DNA的斑点和狭线印迹80

2.12.1基本方案 用多样抽滤加样器在不带电荷的尼龙膜和硝酸纤维素膜上进行DNA斑点和狭线印迹80

2.12.2备择方案1用多样抽滤加样器在带正电荷的尼龙膜上进行DNA斑点和狭线印迹82

2.12.3备择方案2 DNA斑点印迹的手工制备82

2.13DNA印迹的杂交分析83

2.13.1基本方案 放射性标记的DNA探针对DNA印迹的杂交分析84

2.13.2备择方案 用放射性标记的RNA探针对DNA印迹进行杂交分析85

2.13.3辅助方案 从杂交膜上除去探针87

2.14寡核苷酸的合成及纯化89

2.14.1关于核酸的化学合成法的介绍89

2.14.2核酸合成方案92

2.14.3寡核苷酸纯化方案93

2.15变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸94

基本方案94

第3章 DNA和RNA的酶学操作97

3.1限制性内切核酸酶消化DNA97

3.1.1基本方案 单酶切消化单个DNA样品98

3.1.2备择方案1多限制性内切核酸酶消化DNA99

3.1.3备择方案2消化多个DNA样品101

3.1.4备择方案3限制性内切核酸酶对DNA部分消化102

3.1.5辅助方案DNA的甲基化102

3.2核酸操作的常用试剂和放射性同位素103

3.2.1储液溶液103

3.2.210×酶缓冲液106

3.2.3核苷三磷酸110

3.2.4标记核酸的放射性同位素111

3.2.5基本方案 酸沉淀法测定DNA和RNA中的放射性112

3.2.6备择方案 柱离心法从未掺入的前体dNTP分离放射性标记DNA113

3.3DNA依赖的DNA聚合酶114

3.3.1基本方案1缺口翻译标记DNA114

3.3.2基本方案2 DNA的3′端标记115

3.3.3基本方案3修复凸出的3′或5′端以产生平端116

3.3.4基本方案4随机寡核苷酸引物介导的DNA标记116

3.3.5天然T7噬菌体DNA聚合酶118

3.3.6经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶118

3.3.7Taq DNA聚合酶119

3.4不依赖于模板的DNA聚合酶119

末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）119

3.5依赖RNA的DNA聚合酶120

逆转录酶120

3.6依赖DNA的RNA聚合酶121

噬菌体的RNA聚合酶：SP6、T7和T3121

3.7磷酸酶和激酶121

3.7.1细菌碱性磷酸酶（BAP）和小牛肠碱性磷酸酶（CIP）121

3.7.2T4噬菌体多核苷酸激酶122

3.8外切核酸酶122

3.8.1外切核酸酶Ⅶ（exoⅦ）122

3.8.2λ噬菌体外切核酸酶（λxo）123

3.8.3T7噬菌体基因6外切核酸酶123

3.8.4外切核酸酶Ⅲ（exoⅢ）123

3.9内切核酸酶124

3.9.1Bal 31核酸酶124

3.9.2S1核酸酶124

3.9.3绿豆核酸酶125

3.9.4微球菌核酸酶125

3.9.5脱氧核糖核酸酶I（DNA酶I）126

3.9.6无RNA酶活性的DNA酶I126

3.10核糖核酸酶127

3.10.1核糖核酸酶A（RNA酶A）127

3.10.2无DNA酶的RNA酶A127

3.10.3核糖核酸酶H（RNA酶H）127

3.10.4核糖核酸酶T1128

3.11DNA连接酶128

3.11.1T4噬菌体DNA连接酶128

3.11.2大肠杆菌DNA连接酶129

3.12RNA连接酶129

T4RNA连接酶129

3.13DNA片段的亚克隆130

3.13.1基本方案DNA片段的亚克隆130

3.13.2备择方案 凝胶块中DNA片段的连接131

3.14聚合酶链反应构建重组DNA132

基本方案DNA片段亚克隆132

3.15非同位素探针的标记和比色检测136

3.15.1基本方案1用切口平移法制备生物素酰化的探针136

3.15.2基本方案2用随机寡核苷酸引物合成法制备生物素酰化探针137

3.15.3辅助方案 生物素酰化探针的比色法检测138

3.15.4备择方案 制备和检测地高辛标记的DNA探针139

3.16非同位素探针的化学发光检测139

3.16.1基本方案 生物素标记探针的化学发光检测140

3.16.2备择方案 地高辛标记探针的化学发光检测142

3.16.3辅助方案 紫外光源的标准化142

第4章 RNA的制备和分析144

4.1异硫氰酸胍法制备总RNA145

4.1.1基本方案 从组织或培养细胞中一步法分离RNA145

4.1.2备择方案1 CsCl法纯化从培养细胞中提取的RNA146

4.1.3备择方案2 CsCl纯化组织RNA147

4.2酚／SDS法制备植物RNA148

基本方案148

4.3制备细菌RNA149

4.3.1基本方案1从革兰氏阴性菌中分离高质量的RNA149

4.3.2备择方案 从革兰氏阴性菌中快速分离RNA150

4.3.3基本方案2从革兰氏阳性菌分离RNA151

4.4poly（A）+RNA的制备152

基本方案152

4.5用单链DNA探针进行mRNA的S1核酸酶作图分析153

4.5.1基本方案用M13模板进行mRNA的S1作图154

4.5.2备择方案1从双链质粒模板合成单链探针156

4.5.3备择方案2用寡核苷酸探针进行mRNA的定量S1分析156

4.5.4辅助方案S1核酸酶mRNA定量分析的控制（参数）157

4.6核酸酶保护试验157

4.6.1基本方案157

4.6.2辅助方案1模板DNA的制备159

4.6.3辅助方案2 RNA探针的胶提纯159

4.7引物延伸160

基本方案160

4.8RNA的Northern印迹和狭线杂交分析162

4.8.1基本方案 甲醛-琼脂糖凝胶电泳分离RNA的Northern杂交162

4.8.2备择方案1经乙二醛／二甲基亚砜处理的变性RNA Northecn杂交164

4.8.3备择方案2经狭线印迹固定的未分级RNA样品的Northecn杂交165

4.8.4辅助方案Northern印迹探针的除去166

4.9鉴定新转录的 RNA166

4.9.1基本方案 在哺乳动物细胞中的核失控转录167

4.9.2备择方案1用杜恩斯匀浆器分离细胞核169

4.9.3备择方案2蔗糖梯度离心分离细胞核169

4.9.4辅助方案 制备用于核失控转录实验的硝酸纤维素膜170

第5章 重组DNA文库的构建172

5.1基因组DNA文库概述174

5.1.1代表性与随机性174

5.1.2亚基因组文库174

5.1.3基因组DNA文库载体175

5.2cDNA文库概述175

5.3噬菌体文库的扩增176

基本方案176

5.4黏粒和质粒文库的扩增177

基本方案177

第6章 重组DNA文库的筛选179

6.1噬菌体文库的铺平板和转移181

基本方案 噬菌体文库的铺平板和转移181

6.2黏粒及质粒文库的铺平板和转移182

基本方案 黏粒及质粒文库的铺平板和转移182

6.3应用DNA片段作探针183

6.3.1基本方案 在甲酰胺溶液中杂交184

6.3.2备择方案 在水溶液中杂交184

6.4使用合成寡核苷酸作探针185

6.4.1基本方案 在氯化钠／柠檬酸钠溶液（SSC）中杂交185

6.4.2备择方案 在氯化四甲铵（TMAC）中杂交186

6.4.3辅助方案 混合寡核苷酸5′端标记188

6.5噬菌体克隆的纯化189

基本方案189

6.6黏粒和质粒克隆的纯化190

基本方案190

6.7在λ噬菌体噬斑中产生的融合蛋白的免疫筛选190

6.7.1基本方案 用抗体筛选λgt11表达文库190

6.7.2备择方案 在抗体筛选之前用IPTG诱导融合蛋白表达191

6.8在杂交选择和翻译后进行的免疫筛选192

基本方案192

6.9用单克隆抗体表达克隆194

6.9.1基本方案 分离编码细胞表面抗原的cDNA克隆194

6.9.2辅助方案1抗体包被平板的制备197

6.9.3备择方案 分离编码细胞内抗原的cDNA克隆197

6.9.4辅助方案2制备聚偏二乙烯膜包裹的平板199

6.10基于重组方法（RBA）以筛选λ噬菌体文库199

基本方案199

第7章 DNA序列测定204

双脱氧（Sanger）测序法205

化学（Maxam-Gilbert）测序法207

双脱氧法或化学测序法的选择208

放射性标记测序反应的替代208

其他测序技术的进展209

计算机分析210

7.1DNA测序策略210

7.1.1双脱氧测序211

7.1.2化学测序214

7.2构建用于DNA测序的嵌套式缺失体215

7.2.1基本方案1用外切酶Ⅲ构建单向缺失突变体215

7.2.2备选方案用［α-35S］dNTP使DNA免于外切酶Ⅲ消化218

7.2.3基本方案2用Bal31核酸酶构建嵌套式缺失突变体219

7.3制备DNA测序模板223

7.3.1基本方案1制备单链M13噬菌体DNA223

7.3.2基本方案2从小量裂解物中制备λ噬菌体DNA224

7.3.3基本方案3小量制备用于化学测序的重组pSP64CS或pSP65CS质粒DNA225

7.3.4基本方案4小量制备用于双脱氧测序的双链质粒DNA226

7.3.5基本方案5用于双脱氧测序的双链质粒或λ噬菌体DNA的碱变性227

7.3.6基本方案6制备用于热循环测序质粒或噬菌体DNA227

7.4双脱氧法DNA测序228

7.4.1基本方案1用测序酶（经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶）进行标记／终止测序反应230

7.4.2备择方案1使用测序酶和Mn2+的标记／终止测序反应232

7.4.3备择方案2使用Taq DNA聚合酶进行Sanger测序反应232

7.4.4备择方案3用5′端标记引物进行一步法测序反应233

7.4.5基本方案2用α-标记核苷酸进行热循环测序反应234

7.4.6备择方案4用5′端标记引物进行热循环测序反应236

7.4.7备择方案5使用荧光染料标记的引物和终止物进行循环测序236

7.5化学发光双脱氧DNA测序法238

7.5.1基本方案 利用生物素标记引物的化学发光DNA测序法239

7.5.2备择方案1链霉亲和素和生物素酰化碱性磷酸酶两步检测法（间接法）242

7.5.3备择方案2用半抗原标记引物进行测序并用抗体碱性磷酸酶偶联物检测242

7.6化学测序法243

7.6.1基本方案用32 P标记的DNA进行化学测序244

7.6.2辅助方案Tth111I消化和末端标记246

7.7用于测序的变性凝胶电泳247

7.7.1基本方案 测序胶的灌制、电泳及处理248

7.7.2备择方案1缓冲液梯度测序胶251

7.7.3备择方案2电解质梯度测序胶251

7.7.4备择方案3含甲酰胺的测序胶252

第8章 克隆化DNA的诱变253

8.1用简并寡核苷酸在小段DNA序列中产生大量突变254

基本方案254

8.2基因合成：用互为引物的长段寡核苷酸组合目的序列257

基本方案257

8.3PCR介导的随机突变258

8.3.1基本方案DNA序列的突变259

8.3.2备择方案 一个序列文库的突变261

8.4DNA的接头分区诱变262

基本方案262

8.5PCR介导的诱变264

8.5.1基本方案1通过PCR引入限制酶切位点264

8.5.2基本方案2利用PCR引入点突变267

8.5.3备择方案 通过连续PCR引入点突变270

第9章 DNA导入哺乳动物细胞271

转染方法的选择271

优化转染条件272

病毒载体273

哺乳动物细胞培养274

9.1磷酸钙转染法276

9.1.1基本方案 磷酸钙-DNA在HEPES中形成沉淀的转染方法276

9.1.2辅助方案 哺乳动物细胞的甘油／二甲基亚砜休克277

9.1.3备择方案在BES中形成的磷酸钙-DNA沉淀高效转染277

9.2DEAE-葡聚糖转染278

9.2.1基本方案DEAE-葡聚糖转染法的基本操作程序278

9.2.2备择方案 样本实验：检测酶的结构／活性关系280

9.3电穿孔转染法281

9.3.1基本方案 电穿孔法转染哺乳动物细胞281

9.3.2备择方案 植物原生质体细胞的电穿孔转染281

9.4阳离子脂质体介导的真核细胞转染282

9.4.1基本方案1阳离子脂质体介导DNA的哺乳动物贴壁细胞转染283

9.4.2备择方案 阳离子增强脂质体介导DNA的哺乳动物贴壁细胞转染284

9.4.3基本方案2阳离子脂质体介导DNA的悬浮细胞转染285

9.4.4基本方案3阳离子脂质体介导RNA的贴壁细胞转染285

9.4.5基本方案4阳离子脂质体介导杆状病毒DNA的Sf9和Sf21昆虫贴壁细胞转染286

9.4.6辅助方案 阳离子脂质体转染优化条件的微调286

9.5转染哺乳动物细胞的选择288

9.5.1策略安排288

9.5.2基本方案1哺乳动物细胞的稳定转染290

9.5.3基本方案2哺乳动物细胞的选择标记291

9.6遗传报道基因系统概述295

9.6.1报道载体的设计299

9.6.2体外报道分子分析方法299

9.7报道基因活性的同位素分析方法304

9.7.1基本方案1 CTA活性的色谱分析法304

9.7.2备择方案1原位裂解细胞的CAT分析方法306

9.7.3备择方案2 CAT活性的相抽提分析法306

9.7.4基本方案2人生长激素的放射免疫分析法307

9.8非同位素分析报道基因活性309

9.8.1基本方案1萤火虫萤光素酶报道基因分析309

9.8.2备择方案 冻融裂解的细胞的萤光素酶分析310

9.8.3基本方案2β-半乳糖苷酶报道基因的化学发光分析311

9.9用维多利亚水母绿色荧光蛋白（GFP）研究体内蛋白动力学312

9.9.1GFP的应用312

9.9.2GFP的问题313

9.9.3GFP突变体314

9.9.4显微镜设置314

9.10逆转录病毒转导系统概述315

9.10.1逆转录病毒生活周期316

9.10.2有复制能力的载体317

9.10.3无复制能力的载体318

9.10.4包装细胞系和病毒的产生320

9.10.5鼠逆转录病毒323

9.10.6禽逆转录病毒324

9.10.7安全性问题324

9.11建立特异的逆转录病毒产毒细胞系325

9.11.1基本方案 将逆转录病毒载体导入包装细胞系325

9.11.2基本方案2测定病毒滴度：高滴度产病毒细胞克隆的鉴定分离327

9.11.3备择方案 产毒克隆的快速评价328

9.11.4辅助方案 培养细胞的X-gal染色328

9.12制备高滴度逆转录病毒上清的瞬时转染方法329

9.12.1基本方案1将逆转录病毒载体瞬时转染入293细胞系329

9.12.2辅助方案293细胞的生长和保存330

9.12.3基本方案2用逆转录病毒上清感染贴壁细胞332

9.12.4备择方案1旋转感染法感染贴壁细胞332

9.12.5基本方案3用逆转录病毒上清感染非贴壁细胞333

9.12.6备择方案2共培养感染非贴壁细胞333

9.12.7备择方案3旋转感染法感染非贴壁细胞334

9.13大规模制备和浓缩逆转录病毒原液335

9.13.1基本方案 用离心法制备和浓缩病毒原液335

9.13.2备择方案1用聚乙二醇沉淀及层析法浓缩病毒336

9.13.3备择方案2用分子质量截留滤膜进行浓缩336

9.14逆转录病毒原液中辅助病毒的检测337

9.14.1基本方案 通过药物抗性的水平传播鉴定辅助病毒337

9.14.2备择方案1用原病毒检测具复制能力的逆转录病毒338

9.14.3备择方案2用逆转录酶分析法检测辅助病毒338

9.15用逆转录病毒在体外及体内感染细胞339

体外细胞感染339

第10章 蛋白质分析343

蛋白质分类343

蛋白质纯化流程图344

10.1分光光度分析法和比色法测定蛋白质浓度350

10.1.1基本方案1应用A280来测定蛋白质浓度350

10.1.2基本方案2应用Bradford法测定蛋白质浓度350

10.2定量氨基酸的分析351

10.2.1样品准备351

10.2.2计算平均组成352

10.3蛋白质的单向SDS凝胶电泳353

10.3.1电与电泳353

10.3.2安全性考虑353

10.3.3欧姆定律和电泳354

10.3.4基本方案1变性（SDS）不连续凝胶电泳：Laemmli凝胶法355

10.3.5备择方案1Tris-tricine缓冲液系统的PAGE电泳358

10.3.6备择方案2在无尿素条件下用Tris缓冲液分离多肽360

10.3.7备择方案3连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳361

10.3.8备择方案4超薄凝胶的PAGE362

10.3.9辅助方案1一次灌制多块单一浓度凝胶363

10.3.10备择方案5在梯度凝胶中分离蛋白质365

10.3.11辅助方案2一次灌制多块梯度胶367

10.3.12基本方案2在单一浓度的微型凝胶上电泳368

10.3.13辅助方案3制备多块梯度胶370

10.4使用O’Farrell系统的双向凝胶电泳371

10.4.1基本方案1第一向凝胶（等电聚焦）371

10.4.2备择方案1极端碱性、酸性蛋白质的等电聚焦373

10.4.3基本方案2第二向凝胶374

10.4.4备择方案2小型凝胶双向电泳376

10.4.5辅助方案 组织来源的蛋白质样品的溶解和制备377

10.5凝胶中蛋白质的染色377

10.5.1基本方案1考马斯亮蓝染色377

10.5.2备择方案1考马斯亮蓝快染378

10.5.3基本方案2银染法378

10.5.4备择方案2非氨盐银染法379

10.5.5基本方案3快速银染法380

10.5.6辅助方案1考马斯亮蓝和银染染色的凝胶拍照381

10.5.7基本方案3荧光染色382

10.5.8备择方案4非变性胶的荧光染色382

10.5.9辅助方案2荧光染色胶的拍照383

10.6免疫印迹和免疫检测383

10.6.1基本方案1用转移槽转印蛋白质383

10.6.2备择方案1用半干转移系统转印蛋白质385

10.6.3备择方案2染色凝胶的印迹386

10.6.4辅助方案1转印蛋白的可逆染色387

10.6.5基本方案2用第二抗体偶联物进行免疫检测387

10.6.6备择方案3用亲和素生物素偶联的第二抗体进行免疫检测388

10.6.7基本方案3用发色底物显迹389

10.6.8备择方案4用发光底物显迹390

10.6.9辅助方案2膜的清洗和再使用391

10.7凝胶过滤层析391

10.7.1基本方案1脱盐（组分分离）391

10.7.2基本方案2蛋白质的分级397

10.7.3基本方案3分子大小的测定400

10.7.4辅助方案 柱校正401

10.8离子交换层析404

10.8.1设计策略404

10.8.2基本方案1批式吸附和增加盐浓度的阶段梯度洗脱405

10.8.3基本方案2线性梯度洗脱的柱层析407

10.8.4辅助方案 进行小试确定离子交换层析的起始条件409

10.9免疫亲和层析414

10.9.1基本方案 可溶性或膜结合抗原的分离414

10.9.2备择方案1抗原的批式纯化416

10.9.3备择方案2低pH洗脱抗原416

10.10金属螫合亲和层析417

10.10.1基本方案 天然MCAC对可溶性组氨酸尾融合蛋白的纯化417

10.10.2备择方案1变性条件下用MCAC纯化带组氨酸尾的不溶性融合蛋白420

10.10.3备择方案2 MCAC纯化蛋白质的固相复性421

10.10.4辅助方案NTA介质的再生421

10.11多肽和蛋白质的HPLC：准备工作和系统组装422

10.11.1多肽和蛋白质的属性及其在HPLC方法发展的应用422

10.11.2 HPLC中多肽和蛋白质的检测422

10.11.3起始程序423

10.11.4样品的准备425

10.11.5准备流动相425

10.11.6组装HPLC装置426

10.11.7用洗脱液活化泵和低压线426

10.11.8HPLC系统的准备426

10.11.9HPLC系统的梯度延滞（滞留体积）427

10.11.10和柱连接428

10.11.11给HPLC装置设计程序428

10.11.12注射样品428

10.11.13检测功能性HPLC系统428

10.11.14日志428

10.12多肽和蛋白质的HPLC：标准操作条件429

10.12.1HP-SEC的标准操作条件430

10.12.2HP-NPC的标准操作条件431

10.12.3HP-HIC的标准操作条件432

10.12.4HP-IEX的标准操作条件433

10.12.5HP-HILIC的标准操作条件434

10.12.6HP-IMAC的标准操作条件435

10.12.7HP-BAC的标准操作条件436

10.12.8RP-HPLC的标准操作条件437

10.12.9用RP-HPLC技术对多肽和蛋白质混合物脱盐440

10.13肽的反相分离441

10.13.1基本方案15-500PMOL水平肽的反相分离441

10.13.2基本方案2不超过5 pmol肽的反相分离442

10.13.3辅助方案 毛细管HPLC系统的装配443

10.14通过表位标签纯化重组蛋白研究蛋白质互相作用444

基本方案 带表位标签重组蛋白的免疫沉淀444

10.15免疫沉淀446

10.15.1基本方案1用非变性去垢剂溶液裂解的悬浮细胞的免疫沉淀446

10.15.2备择方案1用非变性去垢剂溶液裂解的贴壁细胞的免疫沉淀449

10.15.3备择方案2用变性去垢剂裂解的细胞的免疫沉淀450

10.15.4备择方案3不用去垢剂裂解的细胞的免疫沉淀450

10.15.5备择方案4用抗体-Sepharose偶联物免疫沉淀451

10.15.6辅助方案 制备抗体-Sepharose偶联物453

10.15.7备择方案5用抗Ig血清免疫沉淀放射性标记抗原454

10.15.8基本方案2免疫沉淀-重俘获455

10.16克隆化基因的体外转录和翻译456

基本方案456

10.17氨基酸代谢标记458

10.17.1［35S］标记复合物操作的安全预防458

10.17.2基本方案［35S］标记甲硫氨酸对悬浮培养细胞的脉冲标记459

10.17.3备择方案1贴壁细胞的［35S］甲硫氨酸脉冲标记460

10.17.4备择方案2［35S］甲硫氨酸脉冲示踪标记细胞460

10.17.5备择方案3［35S］甲硫氨酸的长期细胞标记461

10.17.6备择方案4用其他放射性标记的氨基酸进行代谢标记461

10.17.7辅助方案TCA沉淀测定标记掺入量462

10.18分离蛋白质用于微量序列分析463

10.18.1基本方案1测定通过SDS-PAGE转移到PVDF膜上样品的氨基酸序列463

10.18.2辅助方案 准备SDS-PAGE蛋白质样品465

10.18.3基本方案2测定N端封闭蛋白质的内部序列466

10.19蛋白质和多肽的毛细管电泳467

10.19.1使用仪器467

10.19.2战略计划469

10.19.3基本方案1等电点聚焦分离蛋白质469

10.19.4基本方案2蛋白质的分离470

10.19.5基本方案3解析多肽的分离471

10.19.6基本方案4微量制备毛细管电泳：多次分离472

10.19.7备择方案 微量制备毛细管电泳：单次分离473

第11章 免疫学475

11.1酶与抗体的偶联477

11.1.1基本方案 辣根过氧化物酶HRPO与抗体的偶联477

11.1.2备择方案 碱性磷酸酶与抗体的偶联478

11.2酶联免疫吸附分析（ELISA）478

11.2.1基本方案 间接ELISA法检测特异性抗体479

11.2.2备择方案1直接竞争ELISA法检测可溶性抗原480

11.2.3备择方案2抗体夹心ELASA法检测可溶性抗原481

11.2.4备择方案3双抗体夹心ELISA检测特异性抗体482

11.2.5备择方案4直接细胞ELISA法检测细胞表面抗原483

11.2.6备择方案5间接细胞ELISA法检测对表面抗原具有特异性的抗体484

11.2.7辅助方案1正交连续稀释法确定最佳试剂浓度485

11.2.8辅助方案2制备细菌裂解物抗原486

11.3老鼠的免疫487

11.3.1基本方案 制备免疫脾细胞：用可溶性抗原致敏487

11.3.2备择方案1用复合抗原（膜、整个细胞和微生物）进行免疫488

11.3.3备择方案2用电泳分离的抗原进行免疫488

11.4单克隆抗体上清和腹水的制备488

11.4.1基本方案1单克隆抗体上清的制备489

11.4.2备择方案1单克隆抗体上清的大量制备489

11.4.3备择方案2大量制备杂交瘤或细胞系490

11.4.4基本方案2含单克隆抗体的腹水的制备491

11.5单克隆抗体的纯化492

11.5.1基本方案 用蛋白A-琼脂糖进行纯化492

11.5.2备择方案1蛋白A-琼脂糖的备择缓冲液系统493

11.5.3备择方案2用抗原-葡聚糖和抗鼠Ig-葡聚糖进行纯化493

11.6多克隆抗血清的制备494

11.6.1基本方案 用弗氏佐剂免疫制备多克隆抗体495

11.6.2备择方案 应用其他佐剂制备多克隆抗血清496

11.6.3辅助方案 由全血制备血清497

11.7从抗血清、腹水或杂交瘤上清液中纯化免疫球蛋白G组分497

11.7.1基本方案 用饱和硫酸铵沉淀IgG497

11.7.2备择方案 用DEAE-Affi-Gel Blue层析法分级分离IgG498

11.8免疫原性肽的选择499

11.9抗肽抗体的制备501

11.9.1基本方案 通过化学偶联法用MBS将合成肽偶联到载体蛋白上501

11.9.2备择方案 用戊二醛将合成肽通过化学偶联法交联到载体蛋白上502

第12章 DNA-蛋白质相互作用503

12.1从哺乳动物细胞中制备核和细胞质提取物505

12.1.1基本方案 核提取物的制备505

12.1.2辅助方案1细胞核提取方法的优化508

12.1.3辅助方案2细胞质（S-100）组分的制备508

12.2DNA结合在凝胶电泳中的迁移率变动分析509

12.2.1基本方案 迁移率变动分析510

12.2.2备择方案1竞争迁移率变动分析512

12.2.3备择方案2抗体超变动分析512

12.2.4备择方案3多元迁移率变动分析513

12.3用来分析蛋白质-DNA相互作用的甲基化和尿嘧啶干扰分析法514

12.3.1基本方案1甲基化干扰分析法514

12.3.2基本方案2尿嘧啶干扰分析法515

12.4DNA酶Ⅰ足迹分析法517

12.4.1基本方案DNA酶Ⅰ足迹滴定518

12.4.2辅助方案 用光密度及数值分析法决定蛋白质结合的平衡常数520

12.4.3辅助方案 粗制品的DNA酶足迹分析法522

12.5蛋白质与核酸的紫外交联524

12.5.1基本方案 用溴脱氧尿苷（BrdU）取代的探针进行紫外交联524

12.5.2备择方案1用非溴脱氧尿苷（BrdU）取代的探针进行紫外交联526

12.5.3备择方案2原位紫外交联527

12.6用生物素／链霉亲和素亲和系统纯化DNA结合蛋白527

12.6.1基本方案 用生物素／链霉亲和素亲和系统纯化DNA结合蛋白527

12.6.2备择方案1用微型柱进行纯化529

12.6.3备择方案2用链霉亲和素琼脂糖进行纯化530

12.7编码DNA结合蛋白的cDNA克隆的检测、纯化和鉴定530

12.7.1基本方案 用位点识别DNA筛选λgt1 1表达文库531

12.7.2备择方案 用盐酸胍进行干燥膜的变性／复性循环533

12.7.3辅助方案 从重组溶源菌中制备粗提物鉴定DNA结合蛋白的活性533

12.8用克隆化基因在体外合成的蛋白质分析DNA-蛋白质相互作用535

基本方案535

12.9序列特异性DNA结合蛋白的亲和层析纯化536

12.9.1基本方案1 DNA亲和介质的制备536

12.9.2备择方案将DNA偶联于溴化氰活化的琼脂糖上539

12.9.3辅助方案1用制备性凝胶电泳纯化寡核苷酸539

12.9.4基本方案2 DNA亲和层析法541

12.9.5辅助方案2非特异竞争性DNA的选择和制备543

12.10PCR辅助的结合位点选择确定蛋白质-DNA序列的特异性544

12.10.1基本方案544

12.10.2备择方案 从迁移率变动凝胶中分离和分析结合的寡核苷酸548

第13章 酿酒酵母550

13.1酵母菌培养基的制备551

13.1.1液体培养基552

13.1.2固体培养基554

13.1.3菌株的保存与复苏557

13.2酵母菌的培养与操作558

13.2.1基本方案1液体培养基培养558

13.2.2基本方案2固体培养基培养559

13.2.3基本方案3细胞密度检测559

13.2.4基本方案4影印平板检测酵母菌表型559

13.2.5基本方案5交配型的确定559

13.2.6菌株的构建和四分体孢子的分析560

13.2.7辅助方案 解剖针的制作565

13.2.8备择方案 随机孢子分析565

13.3酵母菌基因组转座子的诱变566

13.3.1战略计划567

13.3.2基本方案 利用mTn诱变文库DNA得到酵母菌突变体567

13.3.3辅助方案1小载体聚合酶链反应569

13.3.4辅助方案2 mTn诱变基因产物的表位标记571

13.4酵母菌载体与克隆基因表达产物的检测573

13.4.1基本方案1构建lacZ融合载体研究酵母菌基因调控573

13.4.2基本方案2β-半乳糖苷酶在液体培养基中的检测573

13.4.3备择方案 利用滤纸提取检测法筛选表达β-半乳糖苷酶的酵母菌落574

13.5将DNA导入酵母细胞575

13.5.1基本方案 乙酸锂转化575

13.5.2备择方案 电穿孔转化576

13.5.3辅助方案 单链高分子质量载体DNA的制备578

13.6利用互补作用克隆酵母菌基因579

基本方案579

13.7酵母细胞中质粒的加工581

13.7.1基本方案1从酵母细胞中分离质粒581

13.7.2基本方案2穿梭质粒581

13.7.3基本方案3定位突变质粒缺口修复技术和等位基因修复技术583

13.8克隆化酵母DNA的加工584

13.8.1基本方案1整合性转化584

13.8.2基因置换技术585

13.8.3基本方案5一步整合置换产生修饰基因589

13.8.4备择方案2通过移换产生修饰基因590

13.8.5基本方案6通过铜诱导双重关闭技术产生条件等位基因590

13.9酵母DNA的制备592

13.9.1基本方案 从酵母菌中快速分离质粒DNA592

13.9.2备择方案 酵母染色体DNA的快速分离593

13.10酵母菌RNA的制备594

13.10.1基本方案 热酸性酚抽提法制备酵母RNA594

13.10.2备择方案1玻璃珠制备RNA595

13.10.3备择方案2 poly（A）+RNA的制备595

13.11制备酵母蛋白抽提物596

13.11.1基本方案 原生质球制备及裂解596

13.11.2辅助方案 差速离心法制备细胞核597

13.11.3备择方案1玻璃珠破细胞法598

13.11.4备择方案2液氮破细胞法598

第14章 原位杂交和免疫组织化学600

14.1组织、胚胎及单细胞的固定、包埋及切片601

14.1.1基本方案 组织和胚胎的多聚甲醛固定及石蜡包埋601

14.1.2备择方案 悬浮及培养细胞的PFA固定602

14.1.3辅助方案1成年小鼠的灌注603

14.1.4辅助方案2蜡块中样本的切片604

14.1.5辅助方案3包被载玻片的制备605

14.2冰冻切片605

14.2.1基本方案 样本制备及切片606

14.2.2辅助方案1用于原位杂交的冰冻切片的固定608

14.2.3辅助方案2组织固定和蔗糖灌注609

14.3细胞RNA的原位杂交609

14.3.1基本方案 细胞的石蜡切片杂交实验610

14.3.2备择方案 冰冻切片的杂交613

14.3.3辅助方案1 合成35S-标记的核糖核酸探针614

14.3.4辅助方案2 35S标记的双链DNA探针的合成616

14.4杂交探针的检测616

14.4.1基本方案1胶片放射自显影616

14.4.2基本方案2乳胶放射自显影616

14.4.3辅助方案 放射自显影用稀释乳胶的制备617

14.5放射自显影原位杂交玻片的复染和压片固定618

14.5.1基本方案 吉姆萨（Giemsa）染色618

14.5.2备择方案1苏木精／伊红染色619

14.5.3备择方案2甲苯胺蓝染色620

14.5.4备择方案3 HOECHST染色法620

14.6免疫组织化学法621

14.6.1基本方案1单层生长细胞的免疫荧光标记623

14.6.2备择方案1悬浮细胞的免疫荧光标记623

14.6.3基本方案2组织切片的免疫荧光标记624

14.6.4备择方案2链霉亲和素生物素结合物免疫荧光标记625

14.6.5备择方案3组织切片的免疫金标记626

14.6.6备择方案4组织切片的免疫过氧化物酶标记626

14.6.7备择方案5组织切片的免疫荧光双标记法627

14.7用非同位素探针进行原位杂交和检测627

14.7.1基本方案 荧光原位杂交627

14.7.2杂交信号的放大629

14.7.3非同位素标记探针的酶法检测631

14.8原位PCR和杂交检测低丰度的靶核酸633

14.8.1总体设计633

14.8.2基本方案1用RNA的原位逆转录进行DNA和RNA靶序列的ISPCR扩增636

14.8.3备择方案 一步法逆转录及扩增640

14.8.4基本方案2 ISPCR扩增的靶产物的杂交和检测641

14.8.5辅助方案1 AES浸泡处理载玻片的制备644

14.8.6辅助方案2在载玻片上制备原位PCR样本645

14.8.7辅助方案3用33 P标记寡核苷酸探针646

14.9RNA在脊椎动物的胚胎和器官中的整体标本原位杂交和检测646

14.9.1基本方案1小鼠或者鸡的胚胎以及器官中的整体原位杂交647

14.9.2基本方案2小鼠胚、鸡胚或者器官中RNA杂交的酶学检测648

14.9.3备择方案1非洲爪蟾的整体原位杂交650

14.9.4备择方案2非洲爪蟾胚胎RNA杂交的酶学检测652

14.9.5辅助方案1地高辛标记的RNA探针的合成653

14.9.6辅助方案2用胚胎预吸收Fab片段654

14.10荧光显微镜的原理及使用655

14.10.1荧光分子探针657

14.10.2滤光器以及滤光设备657

14.10.3多频带的滤镜和多燃料荧光658

14.10.4光源658

14.10.5显微镜的物镜659

14.10.6图片分辨率和点散布函数（PSF）659

14.10.7活细胞的荧光显微镜检术660

14.10.8免疫标记：标记固定细胞和组织的一般步骤661

14.11共聚焦显微术基本原理664

14.11.1光分割的原理666

14.11.2共聚焦显微镜的类型667

14.11.3实际操作指南669

14.12原位杂交的测量675

14.12.1基本方案 通过磷光核存储影像决定原位杂交中的放射性同位素标记的异源双链体的分布675

14.12.2辅助方案 制备参考体系677

14.13细胞凋亡的形态：生化性质和流式细胞仪检测678

14.13.1基本方案1使用活体荧光染料的显微镜定量凋亡指数和细胞活力678

14.13.2基本方案2用次G0／G1DNA峰值计算细胞凋亡680

14.13.3基本方案3用TUNEL流式细胞定量凋亡细胞681

14.13.4基本方案4通过TUNEL组织切面中的凋亡细胞的原位杂交683

14.14β-半乳糖苷酶活性的整体封片免疫组化检测684

14.14.1基本方案 β-半乳糖苷酶活性的整体封片染色和免疫组化检测684

14.14.2备择方案 准备大组织的厚切片进行β-半乳糖苷酶染色686

14.14.3辅助方案1保存和组织清洗686

14.14.4辅助方案2石蜡包埋、切片和染色687

第15章 聚合酶链反应（PCR）689

15.1PCR扩增DNA：标准程序和优化690

基本方案PCR扩增DNA：标准程序和优化690

15.2利用PCR产物直接进行DNA序列测定696

15.2.1基本方案1不对称PCR产生的单链产物的双脱氧测序697

15.2.2备择方案1单引物重复扩增制备单链模板以用于双脱氧测序697

15.2.3备择方案2制备用于双脱氧测序的双链PCR产物698

15.2.4备择方案3用λ噬菌体外切核酸酶消化双链PCR产物得到单链进行双脱氧测序699

15.2.5基本方案2用于化学测序的PCR产物的标记699

15.2.6备择方案4 PCR产物的基因组测序700

15.3用于基因组测序及足迹分析的连接介导PCR701

15.3.1基本方案 连接介导的单侧PCR701

15.3.2辅助方案1从单层细胞制备用于DMS足迹分析的基因组DNA705

15.3.3辅助方案2从悬浮细胞中制备用于DMS足迹分析的基因组DNA708

15.3.4辅助方案3用于化学测序的基因组DNA的制备709

15.4PCR产物的分子克隆711

15.4.1基本方案 产生T-A凸出端711

15.4.2备择方案 产生半位点713

15.5PCR扩增RNA（RT-PCR）714

15.5.1基本方案 在最适条件下进行RNA的PCR扩增714

15.5.2备择方案1避免长时间的共沉淀及复性步骤的方法716

15.5.3备择方案2将cDNA直接用于扩增步骤716

15.5.4辅助方案 粗制RNA的快速提取717

15.6利用单侧PCR（锚式PCR）进行cDNA扩增717

15.6.1基本方案1扩增已知序列的下游（3′端）区段717

15.6.2基本方案2扩增已知序列上游（5′端）区段721

15.7通过PCR方法对微量DNA进行定量分析723

基本方案723

第16章 蛋白质的表达726

16.1蛋白质在大肠杆菌中的表达概述727

16.2T7噬菌体RNA聚合酶／启动子表达系统730

16.2.1基本方案 用双质粒系统进行表达730

16.2.2备择方案1质粒编码蛋白的选择性标记732

16.2.3备择方案2通过M13噬菌体mGP1-2感染的表达733

16.3融合蛋白载体表达概述734

16.4融合蛋白的酶解和化学裂解736

16.4.1基本方案1用Xa因子进行融合蛋白的酶解736

16.4.2辅助方案用Xa因子进行变性融合蛋白的裂解737

16.4.3备择方案1用凝血酶进行融合蛋白的酶解738

16.4.4备择方案2与分离介质结合的GST融合蛋白的酶解738

16.4.5备择方案3用肠激酶进行融合蛋白的酶解739

16.4.6基本方案2用溴化氰对融合蛋白进行化学降解740

16.4.7备择方案4用羟胺化学裂解融合蛋白741

16.4.8备择方案5低pH下水解融合蛋白进行化学裂解741

16.5谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白的表达及纯化742

基本方案 谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白的表达及纯化742

16.6硫氧还蛋白融合蛋白的表达和纯化745

16.6.1基本方案 硫氧还蛋白融合蛋白的构建和表达745

16.6.2辅助方案1用弗氏细胞压碎器裂解大肠杆菌748

16.6.3辅助方案2硫氧还蛋白融合蛋白的渗透性释放750

16.6.4辅助方案3用热处理纯化硫氧还蛋白750

16.7杆状病毒表达系统的概述751

杆状病毒表达系统751

昆虫细胞中蛋白质的翻译后修饰753

用杆状病毒表达系统超量表达蛋白质的步骤753

选择杆状病毒转移载体753

16.8昆虫细胞培养的保存及重组杆状病毒的产生757

16.8.1基本方案1昆虫细胞的保存和培养757

16.8.2基本方案2用线性化杆状病毒DNA共转染昆虫细胞759

16.8.3备择方案 用野生型杆状病毒DNA共转染产生重组病毒761

16.8.4基本方案3杆状病毒储液的制备764

16.8.5基本方案4用噬斑试验测定病毒储液的滴度765

16.9用杆状病毒系统表达和纯化重组蛋白767

16.9.1基本方案1用于最初分析的小规模表达767

16.9.2辅助方案1蛋白质生产高峰期的确定768

16.9.3辅助方案2重组蛋白的代谢标记769

16.9.4基本方案2重组蛋白的大规模生产770

16.9.5基本方案3含有多聚组氨酸（6×His）标签重组蛋白的纯化771

16.9.6备择方案 含有GST标签重组蛋白的纯化772

16.10概述：蛋白质在哺乳动物细胞中表达773

16.10.1病毒介导的基因转移774

16.10.2瞬时表达775

16.11用COS细胞瞬时表达蛋白质778

基本方案778

16.12痘苗病毒表达系统概述780

16.13细胞系和痘苗病毒储液的制备783

16.13.1基本方案1贴壁细胞的培养784

16.13.2基本方案2悬浮细胞的培养785

16.13.3基本方案3痘苗病毒储液的制备786

16.13.4辅助方案1噬斑分析测定痘苗病毒储液的滴度787

16.13.5基本方案4鸡胚成纤维细胞的制备788

16.13.6基本方案5 MVA病毒储液的制备789

16.13.7辅助方案2用免疫染色法滴定MVA病毒790

16.14重组痘苗病毒的制备792

16.14.1基本方案1痘苗载体转染（痘苗病毒）感染的细胞792

16.14.2辅助方案1痘苗病毒的纯化796

16.14.3辅助方案2痘苗病毒DNA的提取798

16.14.4基本方案2筛选重组病毒噬斑799

16.14.5基本方案3噬斑扩增801

16.14.6基本方案4重组MVA的活体免疫染色803

16.14.7辅助方案3用刀豆蛋白A包被组织培养板804

16.15重组痘苗病毒及其产物的鉴定804

16.15.1基本方案1应用PCR方法检测痘苗DNA805

16.15.2基本方案2应用Southern杂交检测痘苗病毒DNA807

16.15.3基本方案3应用斑点杂交检测痘苗病毒DNA808

16.15.4备择方案 应用点印迹检测表达的蛋白质809

16.15.5基本方案4应用免疫印迹检测表达蛋白810

16.15.6基本方案5应用免疫沉淀检测表达蛋白811

16.16用痘苗病毒／T7 RNA聚合酶系统表达基因812

16.16.1基本方案1重组痘苗病毒（vTF7-3）感染后的脂质体转染813

16.16.2基本方案2两种重组痘苗病毒共感染细胞815

16.16.3基本方案3单病毒感染OST7-1细胞816

16.16.4基本方案4利用VOTE系统进行基因表达817

16.16.5辅助方案 脉冲标记检测表达的蛋白质818

16.17自主调节的四环素控制系统诱导基因表达819

16.17.1基本方案 磷酸钙介导的pTet-tTAK稳定转染NIH3T3细胞和四环素调控的靶质粒820

16.17.2辅助方案 分析目的基因的蛋白质表达823

16.18从哺乳动物细胞中表达和纯化抗原决定簇标记的多亚基蛋白复合体825

16.18.1基本方案1从组成型表达FLAG标记蛋白的克隆化细胞系中纯化多亚基蛋白复合物826

16.18.2基本方案2从条件性表达FLAG标记蛋白的克隆化细胞系中纯化多亚基蛋白复合体829

16.18.3备择方案 变化起始材料和洗脱条件纯化抗原表位标记蛋白复合体的多种形式831

16.18.4辅助方案用P11离子交换层析柱纯化多种形式的抗原表位标记的蛋白复合体834

第17章 蛋白质磷酸化的分析836

17.1蛋白质磷酸化概述837

17.2s2Pi标记培养细胞和制备用于免疫沉淀的细胞裂解物838

17.2.1基本方案 培养细胞的32Pi标记和温和去垢剂裂解法838

17.2.2备择方案SDS煮沸法裂解细胞840

17.3磷酸氨基酸分析841

17.3.1基本方案 磷酸氨基酸的酸水解和双向电泳分析841

17.3.2备择方案 碱处理提高转移至滤膜上的含磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的蛋白质的检测灵敏度844

17.4分析非标记蛋白质的磷酸化作用845

17.4.1基本方案1用抗磷酸酪氨酸抗体和125I标记蛋白A进行免疫印迹分析845

17.4.2备择方案 用增强化学发光法（ECL）检测结合的抗体846

17.4.3基本方案2磷酸酶消化法鉴定磷酸化的蛋白质847

17.5酶法检测磷酸化作用848

17.5.1基本方案1用非特异酸性磷酸酶消化磷酸蛋白质848

17.5.2备择方案1用非特异碱性磷酸酶消化磷酸蛋白质849

17.5.3基本方案2用丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酶消化磷酸蛋白质850

17.5.4备择方案2用酪氨酸磷酸酶消化磷酸蛋白质850

17.5.5辅助方案 离解32 P的测量和鉴定851

17.6特异性识别酪氨酸磷酸化肽的抗体的制备851

17.6.1基本方案1抗磷酸肽的多克隆抗体的制备851

17.6.2基本方案2抗磷酸肽的单克隆抗体的制备854

17.6.3辅助方案1肽的合成856

17.6.4辅助方案2将肽链交联到AFFI-GEL 10亲和介质上856

17.6.5辅助方案3将磷酸酪氨酸交联到AFFI-GEL 10亲和介质上858

17.7用外源性底物分析蛋白激酶859

17.7.1基本方案1环核苷酸依赖性蛋白激酶的分析861

17.7.2基本方案2蛋白激酶C异构体的分析862

17.7.3基本方案3用β-酪蛋白进行酪蛋白激酶的分析863

17.7.4备择方案 用多肽底物进行酪蛋白激酶的分析863

17.7.5基本方案4 Ca24／钙调蛋白依赖性激酶的分析864

17.7.6基本方案5酪氨酸激酶的分析865

17.7.7基本方案6在凝胶中直接进行激酶的分析866

17.7.8辅助方案1用于激酶分析的细胞裂解方案867

17.7.9辅助方案2三氯乙酸沉淀法测定放射性物质的掺入率868

17.7.10辅助方案3 P81磷酸纤维素膜的吸附868

17.8研究蛋白质磷酸化的渗透策略870

17.8.1基本方案 用渗透细胞进行蛋白磷酸化的分析871

17.8.2备择方案1用于SDS-PAGE的天然细胞样品制备873

17.8.3备择方案2制备用于等电聚焦的天然细胞样品874

17.9磷酸肽图谱和磷酸化位点的鉴定874

17.9.1基本方案1用SDS聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白质的胰蛋白酶磷酸肽图谱875

17.9.2备择方案 固相化蛋白质的水解消化881

17.9.3辅助方案1从纤维素平板上提取磷酸肽882

17.9.4基本方案2用手工EDMAN降解法测定肽中磷酸化氨基酸的位置883

17.9.5基本方案3第二次鉴别性消化以检测磷酸肽中特定氨基酸的存在885

17.9.6辅助方案2用于微序列测定或质谱的磷酸肽的制备886

第18章 生物信息学888

18.1用BLAST程序组进行序列相似性搜索888

18.1.1BLAST概述889

18.1.2搜索策略907

第19章 蛋白质相互作用的分析912

19.1利用相互作用阱／双杂交系统鉴定相互作用蛋白915

19.1.1基本方案1鉴定诱饵蛋白916

19.1.2基本方案2相互作用蛋白的捕获923

19.1.3备择方案1相互作用阱的快速筛选931

19.1.4备择方案2通过相互作用交配进行捕获实验932

19.1.5辅助方案1用于免疫印迹分析的蛋白质提取物的制备934

19.1.6辅助方案2制备鲑精载体DNA935

19.2与GST融合蛋白结合的蛋白质的亲和纯化937

19.2.1基本方案GST融合蛋白的亲和纯化937

19.2.2辅助方案E.col i提取物的制备939

19.3基于噬菌体表达克隆来确认相互作用蛋白质940

基本方案 相互作用克隆941

19.4表面等离子共振技术944

19.4.1基本方案1使用BIAcore芯片的表面等离子共振944

19.4.2基本方案2使用NTA-SAM芯片的表面等离子共振946

19.5用共沉淀法检测蛋白质-蛋白质之间的相互作用946

19.5.1基本方案 用蛋白A／G-琼脂糖共沉淀蛋白946

19.5.2备择方案用GST融合蛋白共沉淀947

19.6用Far Western分析识别蛋白质相互作用948

19.6.1基本方案用Far Western分析蛋白质混合物949

19.6.2备择方案1用免疫印迹技术检测相互作用蛋白质950

19.6.3备择方案2在Far Western blot中用多肽检测特定的相互作用序列951

第20章 染色质的装配与分析953

20.1微球菌核酸酶分析染色质结构954

20.1.1基本方案1渗透化细胞的染色质的微球菌核酸酶消化954

20.1.2基本方案2分离的细胞核的染色质的微球菌核酸酶消化955

20.1.3基本方案3纯化的基因组DNA的微球菌核酸酶消化957

20.1.4辅助方案1染色质消化得到的DNA的纯化和鉴定957

20.1.5辅助方案2核酸酶切割图谱分析策略959

20.1.6辅助方案3使用改进的LM-PCR方法在核苷酸水平上检测MNase对双链的切割961

20.2分离Triton／乙酸／尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分离组蛋白变体和翻译后修饰异构体962

20.2.1基本方案 组蛋白的Triton／乙酸／尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析963

20.2.2辅助方案1凝胶板的组装964

20.2.3辅助方案2从制备的核中分离组蛋白965

20.2.4辅助方案3 TAU-聚丙烯酰胺凝胶的电转移966

20.3用免疫共沉淀的方法从总细胞抽提物中确定与染色质结合的蛋白质967

基本方案 用免疫共沉淀的方法从细胞总抽提物中确定与染色质结合的蛋白质967

20.4从哺乳动物细胞中分离组蛋白和核小体核心971

20.4.1基本方案1精核的制备971

20.4.2基本方案2去H1的寡聚核小体的溶解和纯化972

20.4.3基本方案3单聚及二聚核小体的纯化974

20.4.4基本方案4羟磷灰石层析法纯化核心组蛋白975

20.5用盐透析的方法组装核小体模板975

20.5.1基本方案1用逐步盐透析的方法组装核小体模板976

20.5.2基本方案2用梯度盐透析的方法组装高浓度的单核小体977

20.5.3基本方案3用梯度盐透析的方法组装核小体串978

20.5.4辅助方案1细菌的重组核心组蛋白的纯化979

20.5.5辅助方案2用于单核小体组装的单链5′端标记的DNA的制备980

20.5.6辅助方案3用于组装高浓度非标记的单核小体的DNA的制备981

20.5.7辅助方案4用于核小体串组装的DNA的制备982

20.5.8辅助方案5用琼脂糖凝胶电泳分析重建复合体982

20.5.9辅助方案6用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析重建复合体983

20.5.10辅助方案7通过EcoRI消化确定G5 E4核小体串组装的范围983

20.6使用果蝇系统进行染色质重组984

20.6.1基本方案1果蝇S-190染色质重组抽提物的制备984

20.6.2基本方案2从果蝇胚胎中纯化核心组蛋白985

20.6.3基本方案3用S-190抽提物进行染色质重组988

20.6.4基本方案4重组的果蝇ACF的表达和纯化990

20.6.5基本方案5重组的果蝇NAP -1的表达和纯化991

20.6.6备择方案1重组的果蝇NAP-1的表达和纯化（NTA Surperflow树脂）993

20.6.7基本方案6使用重组的果蝇因子进行染色质装配993

20.6.8备择方案2重组染色质装配反应中的核心组蛋白与DNA比率的滴定995

20.6.9辅助方案 果蝇拓扑异构酶I的核心催化区域的表达和纯化996

第21章 核酸阵列998

21.1核酸阵列概述998

21.1.1微阵列擅长做什么？998

21.1.2核酸阵列还能够做什么？1000

21.1.3关于数据分析1001

21.1.4哪里有更多的信息？1002

21.2用于表达分析的mRNA的制备1003

21.2.1策略安排1003

21.2.2基本方案 用于表达监测以及与寡核苷酸芯片杂交的mRNA扩增1004

21.2.3辅助方案1对照基因的体外转录和转录库的制备1008

21.2.4备择方案cDNA和体外转录产物的固相可逆固定（SPRI）纯化1010

21.2.5辅助方案2 cDNA定量1011

21.3用cDNA阵列技术检测人的基因表达谱1012

21.3.1基本方案1 cDNA扩增和影印1012

21.3.2基本方案2 RNA抽提和标记1016

21.3.3基本方案3杂交和数据处理1019

21.3.4辅助方案1 EST的琼脂糖凝胶电泳1021

21.3.5辅助方案2荧光法测定DNA浓度1023

21.3.6辅助方案3多聚赖氨酸封闭玻片1023

第22章 组合文库的建立和使用1025

22.1构建组合库及文库所用的DNA库的设计、合成和扩增1025

22.1.1基本方案1随机序列库的纯化1025

22.1.2辅助方案1库的复杂度的测定1026

22.1.3辅助方案2库的偏好性的测定1028

22.1.4辅助方案3库扩增的小规模PCR反应的优化1028

22.1.5基本方案2库DNA的大规模扩增1029

22.2肽适配体：用于细胞过程的正向及反向分析的显性遗传学试剂1031

22.2.1基本方案1构建硫氧还蛋白肽适配体组合库1031

22.2.2基本方案2利用双杂交系统相互作用阱／筛选特定蛋白的肽适配体1033

22.2.3基本方案3通过相互作用交配确定识别特异性1035

22.2.4基本方案4肽适配体的亲和力成熟1036

22.2.5基本方案5用肽适配体正向分析细胞过程1038

22.2.6辅助方案 肽适配体靶点的鉴定1039

22.3利用mRNA显示法进行蛋白筛选1040

22.3.1基本方案1制备和纯化mRNA显示蛋白1040

22.3.2基本方案2 mRNA显示蛋白的纯化和逆转录1044

22.3.3基本方案3 mRNA显示蛋白的筛选与扩增1046

22.3.4辅助方案1 FLAG标签的纯化1050

22.3.5辅助方案2诱导突变PCR1050

第23章 单个细胞或一群细胞间差异表达基因的发现和分析1052

23.1差减cDNA文库的建立1052

基本方案 差减cDNA文库的构建1052

23.2基于PCR的差减cDNA克隆1056

23.2.1基本方案 差减cDNA文库的构建1056

23.2.2辅助方案 狭缝斑点杂交监测差减过程1062

23.3mRNA的PCR差异显示1064

基本方案mRNA的PCR差异显示1064

23.4限制性内切核酸酶介导的差异显示（RMDD）1067

23.4.1基本方案RMDD文库的准备和两轮扩增1068

23.4.2备择方案 两阶段PCR扩增1073

23.4.3辅助方案 直接印迹电泳1074

23.5基于AFLP的转录表达谱分析1077

基本方案 基于AFLP的转录表达谱分析1077

23.6基因表达系列分析（SAGE）1083

23.6.1基本方案 基因表达系列分析（SAGE）1083

23.6.2辅助方案1 PCR验证cDNA产物1094

23.6.3辅助方案2优化双标签的PCR扩增1095

附录1试剂和溶液1097

附录2实用测量值和数据1247

附录3生物化学和分子生物学常用技术1264

附录3A凝胶和印迹实验中放射性标记蛋白和DNA的检测及定量1264

附录3B玻璃器皿的硅化1271

附录3C透析与超滤1271

附录3D用吸收光谱法和荧光光谱法定量DNA和RNA1277

附录3E通过沉默突变引入限制性内切核酸酶识别位点1280

附录3F哺乳动物细胞组织培养技术1282

附录3G安全使用放射性同位素1290

附录3H分子生物学家的统计学：组比较1300

附录4试剂和设备的供应商1323

附录5参考文献1368

索引1385