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第1章 序言1

第1章 为什么要纯化酶？3

第1部分 制定纯化流程9

第2章 蛋白质纯化的策略与考虑因素9

1.总则10

2.蛋白质来源14

3.制备提取物15

4.大批量纯化步骤15

5.纯化的精纯过程16

6.结论17

参考文献17

第3章 生物信息学在蛋白质纯化设计中的应用18

1.氨基酸序列中的重要信息19

2.无法从序列中预知的信息22

3.结论22

参考文献23

第4章 准备纯化工作简表24

1.引言24

2.脚注的重要性26

3.SDS-PAGE对分析主要蛋白质分离组分的价值26

4.一些常见的错误和问题26

第2部分 操作蛋白质和酶的常规方法31

第5章 建立一个实验室31

1.配套材料31

2.检测和分析的必要条件32

3.蛋白质分级分离的必要条件33

第6章 缓冲液：原理和实践35

1.引言35

2.理论35

3.缓冲液的选择37

4.缓冲液的制备39

5.挥发性缓冲液40

6.广谱缓冲液41

7.缓冲液储存液的配方41

参考文献48

第7章 酶活性的测定49

1.引言49

2.催化活性的原理50

3.酶活性的检测54

4.反应分析混合物的组成57

5.讨论58

参考文献58

第8章 蛋白质定量60

1.引言61

2.试剂配制的一般性指导65

3.紫外吸收光谱分析65

4.基于染料的蛋白质分析方法67

5.考马斯亮蓝蛋白质浓度分析法（范围：1～50μg）69

6.碱性铜还原分析法（范围：5～100μg）70

7.二喹啉酸法（范围：0.2～50μg）71

8.胺衍生法（范围：0.05～25μg）72

9.基于去污剂的荧光检测（范围：0.02～2μg）73

10.总论74

参考文献76

第9章 蛋白质浓缩和溶质的去除78

1.层析79

2.电泳82

3.透析83

4.超滤85

5.冷冻干燥89

6.沉淀91

7.结晶92

参考文献92

第10章 蛋白质稳定性的保持94

1.蛋白质失活的原因94

2.常规处理方法95

3.浓缩和溶剂条件95

4.稳定性实验和储存条件96

5.蛋白质水解和蛋白酶抑制剂96

6.蛋白质活性丢失97

第3部分 重组蛋白的表达与纯化101

第11章 选择重组蛋白表达的合适方法101

1.引言102

2.大肠杆菌102

3.毕赤酵母104

4.杆状病毒/昆虫细胞105

5.哺乳动物细胞106

6.蛋白质的特性108

7.重组蛋白的应用109

8.结论110

参考文献111

第12章 用于外源蛋白生产的细菌表达系统114

1.引言115

2.使用大肠杆菌生产外源蛋白115

3.设计一个细菌表达方案116

4.方案需求的评估116

5.目标蛋白质的分析116

6.克隆117

7.制备T4 DNA聚合酶处理的DNA片段118

8.大肠杆菌细胞质中的表达119

9.大肠杆菌细胞质中目标蛋白质的表达119

10.大肠杆菌中表达的外源蛋白质的分析120

11.使用自诱导培养基方案的小量表达培养122

12.蛋白质的周质表达123

13.大肠杆菌周质腔中目标蛋白质的表达123

14.小规模渗透休克法123

15.用于外源蛋白质生产的其他细菌系统125

16.其他载体和诱导条件126

17.生产规模126

参考文献127

第13章 毕赤酵母中的表达129

1.引言130

2.其他真菌表达系统130

3.培养基和微生物操作技术131

4.遗传株的构建131

5.基因制备和载体选择133

6.电穿孔转化法134

7.DNA的制备135

8.重组蛋白表达菌株的鉴定137

9.分析方法的建立——酵母印迹法139

10.重组蛋白的翻译后修饰（蛋白酶和糖基化）140

11.挑选具有多拷贝表达框的克隆141

参考文献142

第14章 杆状病毒-昆虫细胞表达系统144

1.引言145

2.杆状病毒生物学和分子生物学的简要回顾145

3.杆状病毒表达载体147

4.杆状病毒表达载体技术——早期147

5.杆状病毒表达载体技术——改进149

6.杆状病毒转移质粒的改进149

7.亲代杆状病毒基因组的改进150

8.杆状病毒-昆虫细胞系统的另一半157

9.杆状病毒表达载体的新一代昆虫细胞宿主158

10.杆状病毒的基本操作方案160

参考文献163

第15章 哺乳动物细胞瞬时基因转移法制备重组蛋白167

1.引言167

2.TGE方法中常用的HEK293和CHO细胞系168

3.用于HEK293和CHO细胞的表达载体170

4.HEK293和CHO细胞系的悬浮培养171

5.转染方法171

6.结论175

参考文献176

第16章 用于蛋白质表达的标签180

1.引言181

2.设计具有标签的蛋白质时需要考虑的因素183

3.蛋白质亲和标签185

4.可溶性标签188

5.标签的去除190

6.结论192

参考文献192

第17章 包涵体蛋白溶解后的重折叠197

1.引言198

2.重折叠时通常需要考虑的因素199

3.常规流程200

4.常规操作方案200

5.对该常规操作流程的评论202

6.蛋白质重折叠条件的筛选实验207

7.其他的重折叠流程210

8.重折叠数据库：REFOLD211

9.提高可溶性蛋白比例的策略212

10.结论213

参考文献213

第4部分 提取物和亚细胞组分的制备219

第18章 蛋白质纯化所需的生物提取物制备的研究进展219

1.引言220

2.化学法和酶法细胞裂解220

3.机械法裂解细胞223

4.结束语225

5.细胞裂解的流程、试剂和技巧225

参考文献231

第19章 亚细胞器及亚细胞结构的分离234

1.引言235

2.亚蛋白质组的提取和初步分离237

参考文献253

第5部分 纯化程序：量产法257

第20章 蛋白质沉淀技术257

1.引言258

2.AS沉淀258

3.PEI沉淀262

4.其他方法265

5.沉淀分离蛋白质的常规操作265

参考文献266

第21章 用于去除核酸的Affi-Gel BLUE和核苷酸结合蛋白质的初步富集267

1.典型的方案268

参考文献269

第6部分 纯化程序：层析方法273

第22章 离子交换层析273

1.引言273

2.原理275

3.固定相277

4.结合条件278

5.洗脱条件281

6.离子交换层析柱的操作283

7.实例：复杂蛋白质混合物的分离285

8.实例：采用整体柱进行高分辨率的分离288

参考文献289

第23章 凝胶过滤290

1.原理290

2.操作291

第24章 羟基磷灰石柱用于蛋白质层析299

1.引言300

2.机制300

3.化学特性302

4.纯化操作规程的开发306

5.实验室规模层析柱的填装307

6.生产规模层析柱的填装308

7.应用309

参考文献311

第25章 疏水作用层析在蛋白质纯化中的理论及应用313

1.原理313

2.HIC吸附剂的最新技术315

3.HIC吸附剂的使用方法316

参考文献319

第7部分 纯化程序：亲和法323

第26章 亲和层析：常规方法323

1.引言324

2.亲和介质的选择325

3.配基的选择327

4.化学吸附作用331

5.纯化方法334

参考文献335

第27章 固定化金属亲和层析：综述338

1.IMAC配基和固相离子的概况339

2.IMAC的应用342

3.结论359

参考文献360

第28章 多羟基反应单克隆抗体的鉴定、生产和使用——用于免疫亲和层析365

1.引言366

2.多羟基反应单克隆抗体366

3.结论377

参考文献378

第8部分 纯化方法：电泳法383

第29章 单向凝胶电泳383

1.背景384

2.聚丙烯酰胺凝胶385

3.方法原理386

4.步骤387

5.凝胶中蛋白质的检测391

6.蛋白质分子质量标准393

7.分子质量测定393

8.制备型电泳394

参考文献395

第30章 等电聚焦和二维凝胶电泳396

1.引言397

2.材料405

3.方法406

参考文献414

第31章 蛋白质凝胶染色法：介绍与概述416

1.介绍417

2.常规考虑418

3.仪器：检测和记录419

4.总蛋白质的检测419

5.磷蛋白的检测427

6.糖蛋白的检测428

参考文献430

第32章 凝胶中蛋白质的洗脱433

1.引言433

2.通过扩散来洗脱凝胶中的蛋白质434

3.用反相HPLC代替SDS凝胶电泳法437

4.电泳洗脱437

5.总结437

参考文献438

第33章 Western Blot的过程与优化，着重于化学发光检测439

1.蛋白质印迹法440

2.蛋白质印迹法的种类441

3.检测方法444

4.化学发光信号446

5.常见问题及其原因449

6.使用化学发光底物的印迹法和操作规程的优化453

参考文献457

第9部分 膜蛋白和糖蛋白的纯化程序461

第34章 去污剂：综述461

1.引言462

2.去污剂结构462

3.溶液中去污剂的性质468

4.利用去污剂的物理化学参数进行膜蛋白的纯化470

5.去污剂的去除及置换471

6.选择合适的去污剂471

7.结论473

参考文献473

第35章 膜蛋白的纯化475

1.引言475

2.膜的制备476

3.天然膜蛋白的增溶477

4.膜蛋白的纯化479

5.去污剂的去除和置换480

6.重组整合膜蛋白的表达和纯化481

参考文献481

第36章 重组G蛋白偶联受体的纯化483

1.引言484

2.蛋白质增溶的一般注意事项484

3.蛋白质纯化的一般注意事项485

4.增溶和纯化重组神经降压肽受体NTS1487

5.纯化的NTS1分析490

6.总结491

参考文献491

第37章 整合膜蛋白在单室脂质体中的无细胞翻译494

1.引言495

2.无细胞翻译系统概述496

3.表达载体497

4.基因克隆498

5.PCR产物纯化500

6.Flexi载体和PCR产物酶切反应501

7.连接反应501

8.转化反应502

9.质粒DNA的纯化503

10.mRNA制备504

11.脂质体的制备504

12.小麦胚芽翻译反应505

13.密度梯度超速离心纯化507

14.脂蛋白体的性质509

15.规模化的注意事项510

16.同位素标记进行结构研究510

17.总结511

参考文献511

第10部分 纯化蛋白质的特性517

第38章 蛋白质纯度测定517

1.蛋白质的组成和活性分析519

2.电泳法520

3.色谱法522

4.沉降速率测定法523

5.质谱法524

6.光散射法524

参考文献525

第39章 蛋白质亚基的存在及其大小和分子质量的测定526

1.引言527

2.化学方法528

3.传输方法530

4.散射方法543

5.蛋白质亚基的存在544

参考文献546

第40章 翻译后修饰蛋白质的定性和定量548

1.引言549

2.用于鉴定PTM的富集技术552

3.蛋白质的硝化修饰559

4.甲基化和乙酰化560

5.质谱分析561

6.CID、ECD和ETD的对比563

7.PTM的定量分析566

8.展望570

参考文献571

第11部分 其他技术579

第41章 表达与纯化的平行方法579

1.引言579

2.基于最终用途的策略580

3.用于构建表达构建体的平行克隆策略582

4.小规模表达筛选以鉴定合适的构建体584

5.用于选择的蛋白质的分析测试587

6.大规模平行表达588

7.总结591

参考文献591

第42章 氧敏感蛋白的分离技术：以［4Fe-4S]-FNR为例593

1.引言594

2.4Fe-FNR的厌氧分离595

3.含FNR的［4Fe-4S］2+族蛋白质的特征601

4.总结604

参考文献605

第12部分 结束语609

第43章 纯化程序的再思考609

1.介绍609

第44章 蛋白质生物化学中重要的却鲜为人知（或易被忽略）的几点611

1.引言611

2.SDS凝胶电泳样品的制备612

3.缓冲液613

4.色谱614

5.过滤过程中的蛋白质吸收615

6.塑料制品中的化学物浸出615

7.尿素中的氰酸盐615

参考文献616

索引617