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绪论 基因工程药物的发展与对策1

概述1

一、国外基因工程药物的现状2

二、国际医药界竞争与趋势5

1．全球化兼并浪潮6

2．美、欧、日三分天下7

3．今后趋势9

三、国内基因工程药物的历史与现状10

1．国内基因工程药物发展的历史10

2．国内基因工程药物发展的现状12

3．我国市场上的生物药品12

四、我国的基因工程新药研发形势严峻16

1．企业规模过小16

2．企业一哄而上16

3．缺乏产业化的接轨机制16

4．专利保护问题17

5．基因工程药品种类少、创新能力薄弱17

6．基因制药支撑产业极其薄弱17

7．产业化后处理技术落后17

五、我国基因制药业发展的机遇与对策18

1．我国生物医药产业面临的发展机遇18

2．我国基因制药业发展的对策19

参考文献21

第一章 基因工程上游构建与原理23

概述23

第一节 质粒不稳定性及其措施23

一、重组分子的结构或分配不稳定性23

二、质粒拷贝数24

三、质粒的多聚体形式25

四、大肠杆菌细胞内有关分裂基因25

五、质粒的存在对生长的影响26

六、质粒不稳定性的措施27

第二节 常见的操纵子28

一、乳糖操纵子28

二、trp操纵子31

三、PL启动子33

第三节 常用的大肠杆菌表达载体33

一、pET载体33

二、携带trp启动子的表达载体35

三、携带λPL启动子的表达载体36

第四节 启动子36

一、保守序列的影响36

二、Lac启动子及其衍生体37

三、T7启动子及pET载体37

四、CspA冷休克启动子38

五、营养可诱导型启动子38

六、转录终止子38

第五节 翻译39

一、RBS及起始密码子上下游序列39

二、下游盒子40

三、翻译终止子40

四、密码子的影响40

五、mRNA稳定性41

第六节 蛋白质的折叠42

一、细胞质内折叠42

1．大肠杆菌细胞内环境42

2．分子伴侣42

二、周质的折叠45

1．周质的环境45

2．Dsb家族蛋白45

3．周质折叠在重组蛋白表达中的应用48

第七节 外源基因表达效率的提高49

一、表达部位50

1．周质中表达50

2．胞外表达52

二、融合蛋白表达52

1．融合蛋白表达的优点52

2．融合技术的缺陷53

3．用于融合蛋白切割的酶53

三、异源蛋白质的降解问题53

1．细胞质降解54

2．周质降解54

四、异源基因表达后活性的检测55

参考文献56

第二章 基因工程菌种库的建立65

第一节 原始菌种库的建立65

一、菌种概述65

二、菌种质量标准66

三、原始菌种库的建立67

第二节 主代种子批的建立68

一、菌种活化68

二、筛选单菌落菌株68

三、高表达量菌株的扩增68

四、主代菌株的冻干68

五、主代菌种的检定68

第三节 工作种子批的建立69

一、菌种的活化69

二、菌种的扩增69

三、工作种子批的建立69

第四节 菌种稳定性69

一、工程菌菌种的稳定性检测69

二、质粒的遗传稳定性检测70

参考文献72

第三章 大肠杆菌工程菌发酵生产的工艺控制73

大肠杆菌工程菌发酵工艺控制概述73

一、概述73

二、基因工程菌发酵的分类74

1．间歇式发酵74

2．分批流加式发酵75

3．连续式发酵75

4．透析式发酵76

5．固定化发酵76

三、工程菌的代谢过程优化控制76

1．途径工程和发酵工程的联合控制76

2．发酵工程和生物反应器的联合控制76

四、生物反应器类型77

第一节 大肠杆菌生长原理78

一、大肠杆菌特性78

二、大肠杆菌生长原理79

三、影响大肠杆菌生长的因素79

1．营养79

2．温度80

3．pH81

4．溶氧81

5．渗透压81

6．水活度82

7．代谢副产物82

第二节 大肠杆菌工程菌高密度发酵工艺控制原理与方法83

概述83

一、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策83

1．工程菌遗传不稳定的表现与机制84

2．质粒的存在对大肠杆菌宿主菌的生理影响84

3．质粒不稳定性的防制措施85

二、包涵体形成的发酵控制86

1．概述86

2．包涵体的形成机理86

3．影响高效表达的重组异源蛋白在大肠杆菌中形成包涵体的因素86

4．改善包涵体形成的措施87

三、醋酸形成的机理与防制措施87

1．醋酸的毒害作用87

2．醋酸积累的机理88

3．溢流代谢与混合酸发酵89

4．菌株特性90

5．防止醋酸形成的措施90

四、培养基的优化91

1．原理91

2．工程菌培养基设计的基本原则91

3．大肠杆菌工程菌培养基设计91

五、流加策略95

1．流加的目的和意义95

2．流加的方法95

六、重组蛋白表达中的高密度发酵溶氧控制99

1．溶氧（DO）的影响99

2．溶氧参数KLa和OUR的测定99

3．KLa和OUR的变化与控制100

4．溶氧与发酵规模的放大102

参考文献105

第四章 嗜甲醇酵母工程菌的发酵生产112

概述112

一、嗜甲醇酵母112

二、毕赤氏巴斯德酵母112

第一节 毕赤氏巴斯德酵母发酵的重组蛋白生产113

第二节 汉逊氏多形酵母与巴斯德毕赤氏酵母的重要区别118

参考文献120

第五章 基因工程药物的分离纯化技术122

概述122

一、蛋白纯化的分离依据122

二、分离纯化的基本过程123

第一节 沉淀124

一、盐析法125

1．原理125

2．影响因素125

3．硫酸铵盐析应该注意的问题126

二、有机溶剂沉淀法126

三、等电点沉淀126

四、非离子多聚物沉淀法127

第二节 生物技术中的膜分离127

概述127

一、微过滤127

二、标准流动净化128

三、超滤128

四、病毒过滤129

五、高效切线流动过滤129

六、膜层析130

第三节 凝胶过滤层析130

一、凝胶过滤层析的原理130

二、凝胶过滤层析介质133

三、凝胶过滤层析的操作133

1．装填133

2．检验134

3．加样134

第四节 离子交换层析134

一、离子交换柱层析原理134

二、离子交换剂种类135

三、交换容量的测定136

1．DEAE树脂交换容量的测定136

2．CM树脂交换容量的测定136

四、离子交换层析的应用策略136

1．容量136

2．起始条件136

3．pH137

4．离子强度137

5．洗脱137

6．应用实例138

五、应用实例138

1．填柱138

2．平衡139

3．层析操作139

第五节 亲和层析139

一、亲和层析的原理140

二、亲和层析载体140

三、载体的处理141

1．载体的活化141

2．配体偶联141

3．间隔手臂141

4．封闭141

四、亲和层析操作142

1．预处理142

2．上样142

3．洗涤142

4．洗脱142

第六节 蛋白质的保存和真空冷冻干燥143

一、蛋白质的保存方法143

1．液态保存143

2．固态保存144

二、真空冷冻干燥的原理144

1．冻干机的组成和冻干程序144

2．冷冻干燥的程序145

3．共溶点及其测量方法146

4．产品的预冻146

5．产品的第一阶段干燥148

6．产品的第二阶段干燥148

7．影响干燥过程的因素149

8．冻干曲线和时序的制定150

9．冻干的后处理152

参考文献153

第六章 基因工程药物的质量控制154

第一节 基因工程药物的原材料的质量控制154

一、对制药用水的质量控制154

二、活体原料的质量控制158

三、投产用的化学试剂的质量控制158

第二节 基因工程药物的中间体的质量控制158

一、发酵或细胞大量培养过程的质量控制158

1．遗传稳定性159

2．产品的产率及产品的稳定性159

3．防止污染159

4．培养基质量160

二、分离纯化过程的质量控制160

第三节 基因工程药物的原液的质量控制161

一、原核表达系统生产的基因工程药物原液质控标准161

二、真核表达系统生产的基因工程药物原液质控标准161

第四节 基因工程药物的半成品质量控制162

第五节 基因工程药物的成品质量控制163

参考文献163

第七章 基因工程药物的稳定性164

第一节 稳定性试验164

一、稳定性报告的内容164

1．产品的一般资料164

2．规格标准和检验方法资料研究164

3．研究设计和研究条件164

4．稳定性数据（资料）165

5．数据分析和结论165

二、稳定性试验设计165

1．总则165

2．目的165

3．批次选择165

4．包装与容器165

5．反映稳定性的指标166

6．试验设置条件166

7．检测频率167

8．冻干制品溶解后的稳定性167

9．加速条件和强力破坏条件167

第二节 原液（原料药）的稳定性168

一、批次选择168

二、样品选择168

三、试验设置及检测频率169

四、原液稳定性验证指标169

1．无保护剂原液样品169

2．有保护剂原液样品169

3．强力破坏条件169

第三节 半成品的稳定性验证169

一、批次选择170

二、样品的选择170

三、试验设置及检测频率170

四、半成品稳定性验证指标170

第四节 成品（制剂）的稳定性170

一、批次选择170

二、样品的选择171

三、试验设置及检测频率171

四、成品（制剂）的稳定性验证指标171

应用实例172

第八章 重组人白介素-2172

第一节 简介172

一、命名172

二、生物学活性172

三、临床应用172

第二节 结构与性质173

第三节 重组人白细胞介素-2的工程菌构建174

第四节 重组人白介素-2的制备175

一、工艺流程175

二、发酵176

1．种子液制备176

2．发酵培养176

三、粗纯176

1．原则176

2．制备程序177

四、精纯178

1．工艺流程178

2．S-200柱／S-100柱装填178

3．平衡179

4．上样179

5．洗脱179

6．收样179

7．柱再生179

五、复性179

1．工艺流程179

2．还原型rIL-2的氧化复性179

3．影响IL-2的氧化复性的因素179

六、反向高效液相纯化rIL-2180

1．RP-HPLC纯化180

2．旋转蒸发去除乙腈181

七、纯化结果与分析181

第五节 重组人白介素-2的质量控制181

参考文献183

第九章 重组人干扰素α2b184

第一节 干扰素简介184

一、命名及分类184

二、生物学活性临床应用184

1．抗病毒作用184

2．抗肿瘤作用184

3．免疫调节作用184

4．消除或修复DNA结构损伤的作用185

第二节 重组人干扰素的结构与性质185

第三节 重组人干扰素α2b的制备185

一、生产工艺流程185

二、干扰素α2b的发酵186

1．种子液的制备186

2．发酵培养187

三、粗纯187

1．原则187

2．细菌的破碎187

3．包涵体的裂解187

4．分段稀释法复性188

5．酸化188

四、精纯188

1．DEAE Sepharose F.F层析188

2．Sepharyl S-100分子筛层析188

3．CM Sepharose F.F柱层析189

五、纯化结果分析190

第四节 重组人干扰素α2b的质量控制标准190

参考文献191

第十章 生长素192

第一节 简介192

一、命名192

二、生物学活性192

三、临床应用192

第二节 结构与活性193

第三节 制备193

一、hGH原料药生产工艺流程图193

二、发酵培养参数194

三、粗提194

四、层析纯化194

第四节 质量监控标准195

第十一章 粒／巨噬细胞集落刺激因子196

第一节 简介196

一、命名196

二、生物学活性196

三、临床应用196

第二节 结构与功能197

第三节 制备197

一、GM-CSF工艺流程及质量控制点197

二、发酵培养参数197

三、粗提197

四、层析纯化198

第十二章 集落刺激因子200

第一节 简介200

一、命名200

二、生物学活性200

三、临床应用200

第二节 结构及活性201

第三节 制备201

一、rhG-CSF原料药生产工艺流程图201

二、酵培养参数201

三、粗提201

四、层析纯化201

第四节 质量监控标准203

第十三章 促红细胞生成素204

一、前言204

二、分子结构及特性204

三、rhEPO的发酵表达205

1．工作细胞复苏205

2．细胞扩增206

3．表达培养206

四、rhEPO的纯化206

五、检定207

1．活性207

2．唾液酸含量207

3．纯度207

4．相对分子质量207

5．等电点207

6．CHO细胞残存蛋白207

7．牛血清残存量207

六、rhEPO的临床应用208

1．慢性肾功能哀竭（CRF）208

2．HIV感染／ZDU治疗病人208

3．类风湿性关节炎208

4．癌性贫血208

5．早产儿贫血208

七、EPO的发展208

第十四章 重组乙型肝炎疫苗210

第一节 总论210

一、乙型肝炎病原学210

二、乙型肝炎的流行病学211

1．传染源211

2．传播途径211

三、乙型肝炎的免疫预防211

1．接种对象211

2．用法211

3．注意事顺212

4．规格212

5．有效期212

四、乙肝肝炎病毒的分子生物学研究212

1．乙肝病毒表面抗原基因与蛋白成分212

2．乙肝病毒表面抗原的三种蛋白212

3．前S1的优势表位212

4．前S2的优势表位212

五、各种乙型肝炎蛋白疫苗的评价213

1．小蛋白疫苗213

2．中蛋白疫苗213

3．大蛋白疫苗213

六、新型疫苗的研制214

1．抗原表位的意义和特点214

2．重组乙型肝炎疫苗的自身特点214

3．乙肝病毒免疫优势表位疫苗的设计和制备215

七、基因工程乙型肝炎疫苗的表达系统217

1．大肠杆菌表达系统217

2．酵母表达系统217

3．昆虫细胞表达系统217

4．CHO表达系统218

5．展望219

第二节 重组（CHO细胞）乙型肝炎疫苗生产工艺219

一、工艺流程219

二、重组CHO细胞的培养220

1．细胞库的建立220

2．生产用细胞的全面检定220

3．生产用主要材料的检定221

4．培养条件221

三、重组CHO乙型肝炎疫苗的纯化222

1．离心纯化法222

2．柱层析纯化法223

3．纯化要点223

第三节 重组CHO乙型肝炎疫苗的质量控制224

一、疫苗原液的质量标准224

1．无菌试验224

2．蛋白含量224

3．电泳纯度224

4．高压液相纯度224

5．牛血清蛋白残留量224

6．DNA残留量224

二、半成品的质量控制224

1．无菌试验224

2．细菌内毒素含量测定224

三、成品的质量控制225

1．鉴别实验225

2．外观225

3．无菌试验225

4．pH值225

5．氢氧化铝含量225

6．硫柳汞含量225

7．游离甲醛含量225

8．效力试验225

9．异常毒性试验225

10．细菌内毒素含量测定225

参考文献226

英汉主题词对照228

汉英主题词对照234