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目 录1

1概论1

1.1 分子生物学诊断技术的崛起1

1.2 常用的分子生物学诊断技术2

1.2.1 用于分子生物学诊断的主要靶基因序列2

1.2.2 常用的分子生物学诊断技术2

1.3 分子生物学诊断技术与微生物分子生态学9

1.4 分子生物学诊断技术在环境中的应用11

1.4.1 诊断污染环境中微生物的群落结构和种群丰度11

1.4.2 诊断污染环境中微生物的群落动态12

1.4.3 诊断污染环境中微生物质粒的分子生态效应12

1.4.4 监测和预警环境污染状况13

1.5 分子生物学诊断技术展望14

1.4.5 与降解有关基因的分子多态性14

2 免疫技术对环境中污染物的检测16

2.1 免疫分析的原理及类型16

2.1.1 免疫分析的原理16

2.1.2 免疫分析的分类17

2.2 应用免疫分析技术检测环境中的残留农药19

2.2.1 采用ELISA检测残留农药的改进方法19

2.2.2 ELISA检测残留农药的一般程序20

2.3 采用分子诊断技术对环境中毒素的检测分析26

2.3.1 采用免疫分析对真菌毒素的分子诊断26

2.3.2 采用免疫分析技术对细菌毒素的分子诊断31

2.3.3 采用免疫分析技术对其他生物毒素的检测32

2.4 免疫技术对环境中其他重要污染物的检测33

3生物传感器对环境污染物的检测36

3.1.1 基础电极设计的一般原则37

3.1 生物传感器的基本原理37

3.1.2 生物传感器应具备的特性38

3.2 生物传感器的研究现状39

3.2.1 酶传感器39

3.2.2微生物传感器41

3.2.3免疫传感器43

3.2.4 组织传感器45

3.2.5 其他新型免疫传感器47

3.3 采用生物传感器对环境中的污染物进行监测50

3.3.1 采用生物传感器对环境参数的监测50

3.3.2 生物传感器对毒素物质的检测53

3.3.3 利用生物传感器对残留农药的检测53

3.3.4 采用传感器对重要污染物的检测57

3.3.5 生物传感器对有机大分子的检测62

3.3.6 生物传感器对环境中金属离子的检测64

4基于分子诊断技术的环境致病微生物检测66

4.1 利用PCR技术检测环境中的致病微生物66

4.1.1 聚合酶链式反应66

4.1.2 采用PCR技术检测病原菌73

4.1.3 采用PCR检测环境中的病毒78

4.1.4 PCR检测环境中的寄生虫81

4.2 利用寡核苷杂交技术检测致病微生物84

4.2.1 核酸探针杂交技术84

4.2.2 采用DNA探针检测病原微生物99

4.3 利用免疫分析技术检测致病微生物107

4.3.1 免疫分析法检测病原细菌107

4.3.2 ELISA法检测病原真菌108

4.3.3 ELISA法检测病毒109

4.4.1 检查某些细菌的专有酶进行快速鉴定111

4.3.4 ELISA法检测病原虫111

4.4检测环境中病原微生物的其他快速方法111

4.4.2 快速检测细菌生化反应的色原或荧光底物及成套鉴定系统112

4.4.3 应用不同载体的快速凝集试剂检查与鉴定微生物112

4.4.4 快速检出细菌的毒素112

4.4.5 快速的细菌对抗菌药物的敏感性试验113

4.4.6 化学传感器对病毒的快速监测113

5 采用生物芯片检测环境微生物115

5.1 生物芯片的工作原理115

5.1.1 基因芯片115

5.1.2 蛋白质芯片120

5.1.3 芯片实验室120

5.2.1制备靶分子121

5.2.2 靶分子和分子探针进行杂交121

5.2 基因芯片检测分析环境样品的步骤121

5.2.3 结果检测和数据分析122

5.3 DNA芯片在环境病原微生物检测中的应用123

5.3.1 检测病原体的耐药性124

5.3.2 快速诊断环境致病微生物126

5.4 基因芯片技术的研究方向及当前面临的困难130

6环境微生物的分子分类132

6.1 微生物的分类系统132

6.1.1 微生物的分类命名与鉴定132

6.1.2 分类方法136

6.2 DNA组成（G+C）分析137

6.2.1 DNA中G十C含量的摩尔分数137

6.2.2 G+C含量在细菌分类鉴定中的作用139

6.2.3 测定基因组DNA的G+C含量140

6.3.1 DNA的变性和复性145

6.3 DNA-DNA分子杂交技术145

6.3.2 DNA-DNA分子杂交技术149

6.4 16S rRNA序列分析技术152

6.4.1 16S rRNA的分子结构152

6.4.2 16S rRNA序列分析技术156

6.4.3 16S rDNA测序与细菌分类地位的确定158

6.4.4 基于16S rDNA的系统发生分类法160

6.5 rDNA转录间隔区序列分析技术161

6.5.1 23S rRNA的分子结构161

6.5.2 16S-23S rDNA间隔区163

6.5.3 16 S-23S rDNA ISR在细菌分类和鉴定中的应用165

6.5.4 真菌rDNA基因间隔区段序列分析及其应用166

6.6 分子系统发育进化树的构建168

6.6.1 分子进化的基本概念168

6.6.2 分子进化模型与序列分歧度计算169

6.6.3 分子系统树的构建172

7分子标记技术与环境微生物多样性分析177

7.1 限制性片段长度多态性分析及其在环境微生物检测中的应用177

7.1.1 RFLP分析的基本原理177

7.1.2 DNA片段的变异178

7.1.3 RFLP的操作步骤与应用范围180

7.2 随机扩增多态性DNA技术及应用181

7.2.1 RAPD技术的基本原理181

7.2.2 RAPD技术的操作程序182

7.2.3 RAPD在微生物分类鉴定中的应用183

7.3 DNA单链构象多态（SSCP）技术184

7.3.1 PCR-SSCP技术的基本原理184

7.3.2 操作程序185

7.3.3 PCR-SSCP的优缺点分析186

7.3.4 SSCP技术在检测突变方面的应用187

7.4 扩增的限制性片段长度多态性（AFLP）技术187

7.4.1 AFLP的基本原理187

7.4.2 操作程序188

7.4.3 AFLP技术的应用190

7.5 扩增性限制性酶切片段分析及其应用191

7.5.1 ARDRA的基本原理191

7.5.2 ARDRA的操作程序191

7.5.3 ARDRA技术的应用192

7.6 AP-PCR的指纹图谱195

7.6.1 AP-PCR的基本原理195

7.6.2 AP-PCR指纹图谱在微生物菌体鉴别中的应用195

7.6.4 tRNA基因重复序列之间的PCR196

7.6.3 RNA的AP-PCR的指纹图谱196

7.7 其他环境微生物多样性分析的分子标记技术197

7.7.1 特异引物的PCR标记197

7.7.2 ISSR标记199

7.7.3 T RFLP199

7.7.4 PCR-DGGE方法200

7.7.5 温度梯度胶电技术202

8环境微生物基因组和蛋白质组分析203

8.1 环境微生物基因组分析203

8.1.1 微生物基因组计划进展203

8.1.2微生物基因组测序的策略203

8.1.3微生物基因组的注释205

8.2 嗜盐古细菌sp.NRC-1基因组概述206

8.3 嗜热自养甲烷杆菌δ H菌株基因组概述207

8.4詹氏甲烷球菌208

8.5 闪烁古生球菌210

8.6 环境群体微生物基因组的比较分析212

8.6.1 天然微生物聚集体中的基因组212

8.6.2 自然菌群基因组大片段文库213

8.6.3 多变性——微生物群体基因组214

8.7 环境微生物蛋白质的大规模分离技术214

8.7.1 蛋白质双向电泳技术215

8.7.2色谱－质谱技术230

8.7.3 一维电泳（色谱）－质谱技术232

8.8 环境微生物的高通量蛋白质鉴定技术232

8.8.1 生物质谱技术233

8.8.2 2-DE胶上蛋白质识别与鉴定技术233

8.8.3 生物质谱新技术234

8.9.1 环境胁迫条件下的微生物蛋白质组学235

8.9 环境微生物蛋白质组学235

8.9.2 病原微生物蛋白质组学236

8.9.3 与微生物生理生化相关的定量蛋白质组学236

8.9.4 亚蛋白质组学在环境微生物研究的应用237

8.9.5 基因工程微生物蛋白质组学237

8.10 微生物群落蛋白质组学238

8.10.1 微生物群落蛋白质组学238

8.10.2 自然微生物群落的蛋白质提取239

9 利用分子诊断技术监测微生物群落结构和群落动态241

9.1 FISH技术在微生物群落结构和群落动态研究中的应用241

9.1.1 FISH技术发展和关键操作环节241

9.1.2 采用FISH技术鉴定和定量分析特异微生物243

9.1.3 应用FISH技术监测微生物群落结构、功能和动态246

9.1.4 FISH技术应用时的主要问题252

9.2.1 DGGE技术253

9.2 应用DGGE技术监测微生物群落结构和群落动态253

9.2.2 DGGE的操作方法256

9.2.3 应用DGGE技术监测微生物的群落动态256

9.3 应用SSCP分析技术监测微生物的群落动态258

9.3.1 SSCP在分析监测微生物群落动态中的可行性258

9.3.2 应用SSCP分析技术监测微生物的群落动态258

10环境微生物群落功能基因与表达分析262

10.1 环境微生物群落功能基因与定位262

10.1.1 多环芳烃降解基因262

10.1.2 氨单加氧酶基因264

10.1.3有机磷水解酶基因266

10.1.4 酚类化合物降解基因267

10.1.5脱色相关基因269

10.1.6其他降解基因271

10.2 环境微生物群落功能基因表达分析272

10.2.1 Northern blotting杂交技术272

10.2.2 蛋白质二维（双向）电泳在降解微生物表达分析中的应用277

10.2.3 Western blot杂交技术278

10.2.4 原位PCR的功能基因原位表达分析283

10.2.5 生物芯片的功能基因原位表达分析287

11 分子诊断技术与生物信息学292

11.1 生物信息学研究的主要内容293

11.1.1 获取人类和各种生物的完整基因组293

11.1.2 发现新基因和新的单核苷酸多态性294

11.1.3 研究基因组中非编码蛋白质区域的结构与功能295

11.1.4 在基因组水平上研究生物进化296

11.1.5 比较完整的基因组296

11.1.6 从功能基因组到系统生物学296

11.1.7 蛋白质结构模拟与药物设计297

11.2.1 分子生物学数据库298

11.2 生物信息数据库与查询298

11.2.2 基因库的Entrez浏览检索307

11.2.3 BLAST程序309

11.3 系统进化与序列分析316

11.3.1 分子进化钟与中性理论316

11.3.2分子进化树318

11.3.3 基因组序列信息分析325

11.4 杂交探针与PCR引物的设计328

11.4.1 探针和引物设计优化328

11.4.2探针和引物设计331

11.4.3 进行分子诊断时常用的分子生物学软件介绍331

12.1 引起生物安全问题的主要因素337

12.1.1 生物入侵337

12分子生物学诊断技术与生物安全性337

12.1.2 生物多样性的破坏339

12.1.3 有害生物340

12.1.4基因流动340

12.2 转基因生物的安全性341

12.2.1 转基因植物及其安全性341

12.2.2 转基因动物及其安全性345

12.2.3 转基因微生物及其安全性350

12.2.4 医药生物技术及其产品的生物安全355

12.3 基于分子生物学诊断技术的生物安全性监测与评价361

12.3.1 转基因植物安全性监测与评价361

12.3.2 分子诊断技术用于转基因动物安全性监测与评价365

12.3.3 分子诊断技术用于转基因微生物安全性监测与评价368

12.3.4 分子诊断技术用于医药生物技术及其产品的安全性评价372

参考文献382