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上篇　理论部分3

1 绪论3

1.1　基因工程发展简史3

1.1.1　基因工程的理论基础5

1.1.2　基因工程的技术源泉5

1.2　基因工程的研究内容6

1.2.1 基因工程的概念6

1.2.2　基因工程的研究内容7

1.2.3　基因工程的基本流程8

1.3　基因工程的应用9

1.3.1　基因工程在工业领域的应用9

1.3.2　基因工程与农业9

1.3.3　基因工程在医药领域中的应用10

2　基因工程的分子生物学基础13

2.1 核酸的结构与功能13

2.1.1　遗传物质与DNA14

2.1.2 DNA的结构与功能16

2.1.3 RNA的结构与功能21

2.1.4　核酸的理化性质及其应用23

2.2　基因与基因组24

2.2.1　基因及其结构25

2.2.2　基因组28

2.3 中心法则与基因表达调控33

2.3.1 中心法则与生物信息的传递33

2.3.2　基因的表达与调控37

2.4 自然界的基因转移和重组45

2.4.1 接合作用45

2.4.2　转化及转导46

2.4.3　转座46

2.4.4　基因重组47

3　基因工程工具酶49

3.1 限制性核酸内切酶49

3.1.1　细菌的限制-修饰系统50

3.1.3 限制性内切酶的分类51

3.1.2　限制性内切酶的命名51

3.1.4 限制性内切酶的识别序列的特征52

3.1.5　限制性内切酶的切割方式52

3.1.6　同裂酶和同尾酶54

3.1.7　限制性内切酶识别序列出现的几率及酶切片段的估算54

3.1.8　影响限制性内切酶活性的因素54

3.2 DNA连接酶56

3.2.1　作用机制及特点56

3.2.2 DNA连接酶的分类56

3.3 DNA聚合酶57

3.3.1 DNA聚合酶I57

3.3.2 Klenow片段58

3.3.3 T4 DNA聚合酶58

3.3.5　反转录酶59

3.3.6　Taq DNA聚合酶59

3.3.4 T7 DNA聚合酶59

3.4　其他DNA修饰酶60

3.4.1　碱性磷酸酶60

3.4.2　核酸酶（核酸外切酶）60

3.4.3 S1核酸酶60

3.4.4 DNA酶（DNase）60

3.4.5 RNA酶（RNase）60

3.4.7　末端脱氧核苷酸转移酶61

3.4.6 T4多聚核苷酸激酶61

3.5　核酸探针的标记62

3.5.1 探针62

3.5.2　核酸探针标记物的选择63

3.5.3　探针的标记策略63

4　基因操作的主要技术65

4.1 核酸的提取与纯化65

4.1.1　碱裂解法抽提质粒DNA67

4.1.2　密度梯度离心法提取质粒DNA67

4.1.3 mRNA的分离与纯化68

4.2 DNA的凝胶电泳69

4.2.1 电泳的基本原理69

4.2.2　琼脂糖凝胶电泳70

4.2.3　脉冲场电泳71

4.3　分子杂交技术72

4.3.1 Southern印迹杂交74

4.3.2 Northern印迹杂交74

4.3.3 Western印迹杂交74

4.4　基因扩增技术75

4.4.1 聚合酶链式反应（PCR）75

4.4.2 NASBA技术81

4.5 DNA测序技术82

4.5.1 Sanger双脱氧链终止法83

4.5.2 Maxam-Gilbert化学修饰法84

4.5.3 DNA序列分析自动化84

4.5.4 DNA杂交测序法85

4.6　基因文库构建86

4.6.1　基因文库技术86

4.6.2　基因文库构建87

4.7 DNA与蛋白质相互作用研究策略89

4.7.1　凝胶阻滞试验90

4.7.2 DNase I足迹法90

4.8　蛋白质与蛋白质相互作用研究策略91

4.8.1　酵母双杂交技术92

4.8.2　噬菌体表面呈现技术93

4.8.3　分离的泛素系统94

4.8.4　λ分子对接计算机模拟法95

5　基因工程载体96

5.1　质粒载体96

5.1.1　与构建克隆载体相关的质粒的性质96

5.1.2　构建质粒克隆载体的基本策略97

5.1.3　质粒克隆载体的构建98

5.2.1　λ噬菌体克隆载体101

5.2　λ噬菌体载体101

5.2.2 cosmid克隆载体105

5.2.3 M13噬菌体克隆载体108

5.3 大分子DNA克隆载体110

5.3.1　细菌人工染色体110

5.3.2　酵母人工染色体110

5.4　病毒载体112

5.4.1 CaMV克隆载体112

5.4.2　烟草花叶（TMV）克隆载体113

5.4.3 SV40克隆载体114

5.4.4　反转录病毒克隆载体115

5.4.5　痘苗病毒克隆载体117

5.5　基因打靶载体117

6 目的基因的分离与克隆120

6.1 目的基因的化学合成121

6.2　通过PCR相关技术获取目的基因124

6.2.1 目的基因的直接克隆125

6.2.2 目的基因的间接克隆127

6.3　通过建立基因文库分离目的基因130

6.4　基因的图位克隆133

6.4.1　染色体步移法133

6.4.2　染色体登陆134

6.5　转座子标签法克隆目的基因135

6.6 mRNA差异显示表达分析法克隆特异性表达基因136

6.7　基于EST序列的电子克隆138

6.8 从靶蛋白入手分离编码该蛋白的基因140

7　基因的体外重组和转化141

7.1 DNA片段的体外连接141

7.1.1　黏性末端的连接141

7.1.2　平齐末端的连接146

7.1.3 PCR产物的连接150

7.1.4 DNA体外连接应注意的事项152

7.2　重组体导入细胞153

7.2.1 感受态细胞的制备153

7.2.2　重组DNA分子的转化与农杆菌介导转化法155

7.4　重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染156

7.3　重组λ噬菌体DNA的体外包装与转导156

8　重组体的筛选和鉴定159

8.1　遗传学检测法159

8.1.1 利用载体提供的表型特征筛选重组体159

8.1.2　利用插入序列提供的表型特征筛选164

8.2 DNA电泳检测法165

8.2.1　酶切检测165

8.2.2 PCR检测166

8.3　核酸分子杂交检测166

8.4　免疫化学类检测法167

8.4.1　放射免疫测定法168

8.4.2　免疫沉淀检测法169

8.5.1　杂交抑制的转译170

8.5.2　杂交释放的转移170

8.5　转译筛选法170

9　克隆基因的表达及其产物的检测172

9.1 克隆基因在原核细胞中的表达172

9.1.1　克隆基因在原核细胞中的表达过程172

9.1.2　克隆基因在原核细胞中的表达调控173

9.1.3　克隆基因的原核表达系统175

9.2　克隆基因在真核细胞中的表达180

9.2.1 克隆基因在真核细胞中的表达过程180

9.2.2　克隆基因在真核细胞中的表达调控181

9.2.3　克隆基因的真核表达系统183

9.3　克隆基因表达产物的检测186

9.3.1 外源基因转录产物的检测186

9.3.2　外源基因翻译产物的检测186

10　基因工程安全与规范189

10.1　转基因技术的成就与风险189

10.1.2　星联玉米事件190

10.1.3 内布拉斯加州大豆事件190

10.1.1 普兹塔依（Pusztai）事件（又称转基因马铃薯事件）190

10.1.4　巴西坚果事件191

10.2　转基因生物与食品安全191

10.3　转基因生物与环境安全192

10.4　转基因生物技术存在争议的若干问题195

10.4.1　食品安全争议195

10.4.2　营养富集争议195

10.4.3　药食关系争议195

10.4.4　生态影响争议196

10.4.5　基因污染争议196

10.4.6　全球监管争议196

10.4.7　机遇泡沫争议197

10.5　基因工程的安全管理197

10.5.1　基因工程研究实验室的安全管理准则197

10.5.2　基因工程产品的法规198

11.1　转基因动物技术的发展201

1 1 转基因动物技术201

下篇　应用部分201

11.2　转基因动物技术的研究现况202

11.2.1　显微注射法203

11.2.2　逆转录病毒载体法205

11.2.3　胚胎干细胞（ES）法207

11.2.4　精子载体法（SMGT）207

11.2.5　利用体细胞核移植制备转基因动物211

11.2.6　体细胞的基因打靶与NT制备转基因动物技术214

11.2.7 YAC和BAC的转基因技术216

11.3　转基因动物技术的主要用途219

11.3.1　利用转基因动物建立人类疾病和药物筛选模型219

11.3.2　研究基因的功能和作用220

11.3.3　转基因动物在病毒研究方面的应用222

11.3.4　利用转基因技术改良动物品种和生产性能222

11.3.5　利用转基因动物生产人用器官移植的异体供体223

11.3.6　利用转基因动物生产人药用蛋白和营养保健蛋白224

11.3.7　利用转基因动物技术生产人抗体226

11.4.1　转基因技术与其他生物新技术结合227

11.4　存在问题和发展前景227

11.4.2　新的转基因技术展望228

11.4.3　转基因动物生物反应器的展望229

11.4.4　转基因家畜的前景230

11.5　结语231

12　转基因植物233

12.1 概述233

12.1.1　植物基因工程的研究内容233

12.1.2　植物基因工程的发展现状和前景234

12.1.3　转基因植物的安全问题236

12.2　植物目的基因的转化238

12.2.1 植物基因工程的载体和受体238

12.2.2　根癌农杆菌Ti质粒载体介导的转化系统240

12.2.3　植物病毒载体介导的转染系统246

12.2.4　基因枪转化系统249

12.2.5　植物遗传转化的其他方法251

12.3.1 概述253

12.3　转基因植物的检测与鉴定253

12.3.2　植物基因工程中常用的报告基因254

12.3.3　转基因植物的检测256

12.4　转基因技术在植物中的应用259

12.4.1　利用转基因植物生产重组异源蛋白259

12.4.2　转基因技术在植物品种改良中的应用259

13　基因工程药物264

13.1 基因工程药物发展概况264

13.1.1　基因工程药物发展简史264

13.1.2　基因工程药物现状265

13.1.3　我国基因工程药物的发展265

13.1.4　基因工程制药的特点265

13.2　基因工程药物266

13.2.1　基因工程激素类药物266

13.2.2　基因工程细胞因子类药物269

13.2.3　基因工程抗体272

13.2.4　基因工程受体273

13.2.5　基因工程疫苗274

14　基因芯片276

14.1 基因芯片的基本概念、分类、工作原理和流程277

14.1.1　基因芯片定义277

14.1.2　基因芯片分类及特点277

14.1.3　工作原理278

14.2　基因芯片的制作279

14.2.1　芯片的设计279

14.2.2　片基处理280

14.2.3　探针合成280

14.2.4　点样后处理282

14.3　芯片实验的主要步骤283

14.4　芯片实验结果评估285

14.5　基因芯片的生物信息学分析和数据采掘286

14.5.1 概述286

14.5.2　生物信息学数据库分类287

14.5.3　基于基因芯片的数据分析288

14.6　基因芯片应用292

14.7 MIAME规则294

14.8　芯片行业介绍295

14.9　基因芯片相关网站介绍297

15　人类基因组计划298

15.1 DNA测序298

15.1.1　完成DNA测序的研究机构298

15.1.3 DNA测序与拼装299

15.1.2 DNA测序的原理299

15.1.4 DNA序列的解读301

15.2　后基因组时代301

15.2.1　疾病诊断和预测302

15.2.2　疾病的基因干预和治疗304

15.2.3　药理基因组学305

15.2.4　遗传顾问306

附录A　基因工程研究人员软件解决方案307

参考文献309