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第1章　基因工程技术1

1.1　基因工程技术基本原理与实践1

1.1.1　基因工程简述1

1.1.2　基因工程技术实践2

1.2　原核生物基因工程技术6

1.2.1 目的DNA的获得6

实验1　细菌基因组DNA的制备7

实验2　植物基因组DNA的制备和分析8

实验3　动物细胞基因组DNA的制备10

实验4　PCR扩增目的DNA11

1.2.2　大肠杆菌质粒载体的制备16

实验5　碱裂解法17

实验6　小量一步提取法19

实验7　试剂盒法19

1.2.3　载体和目的DNA的限制酶消化20

实验8　基因组DNA的限制酶消化21

实验9　质粒载体的限制酶消化21

实验10　DNA片段的回收纯化23

1.2.4　载体与目的基因的体外重组25

实验11　载体和目的基因的体外重组26

实验12　PCR产物的TA重组26

1.2.5　重组质粒导入大肠杆菌29

实验13　CaCl2介导转化法30

1.2.6　转化菌落的筛选32

实验14　PCR法快速筛选阳性克隆33

实验15　菌落原位杂交34

1.3　真核生物（酵母）的基因工程37

实验16　酵母基因组DNA的提取38

实验17　酵母细胞质粒DNA的分离39

实验18　酵母细胞的转化40

实验19　酵母单杂交42

主要参考文献44

第2章　蛋白质工程技术46

2.1　蛋白质工程技术原理46

2.2　蛋白质工程技术47

2.2.1　重组蛋白质的表达47

实验1 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达49

实验2　重组蛋白在酵母中的诱导表达51

2.2.2　重组表达蛋白的分离纯化53

实验3　金属螯合层析法纯化带组氨酸标签的蛋白质54

实验4　谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白57

实验5　从包含体中纯化表达蛋白59

实验6　利用凝胶过滤层析更换缓冲液62

2.2.3　蛋白质溶液的浓缩64

实验7　超滤法浓缩蛋白质溶液65

实验8　透析法浓缩蛋白溶液67

2.2.4　蛋白质浓度测定68

实验9　Bradford检测法68

实验10　Lowry检测法70

2.2.5　蛋白质鉴定方法71

实验11　蛋白质的SDS-PAGE71

实验12　双向聚丙烯酰胺凝胶电泳74

实验13　蛋白质印迹82

2.2.6　蛋白质的定点突变85

实验14　重叠延伸产生特异位点突变85

主要参考文献88

第3章　植物细胞工程技术89

3.1　植物细胞工程原理89

3.2　植物细胞工程技术90

3.2.1　植物组织培养技术90

实验1　植物组织培养常用培养基的配制及灭菌91

实验2　烟草组织快繁技术95

实验3　植物细胞悬浮培养技术96

3.2.2　植物原生质体分离与细胞融合技术99

实验4　烟草叶片原生质体的分离与培养100

3.2.3　植物体细胞杂交105

实验5　电激法诱导植物原生质体融合106

实验6　聚乙二醇诱导植物原生质体融合107

3.2.4　植物转基因技术109

实验7　叶盘法转化烟草111

实验8　真空渗入法转化拟南芥114

实验9　基因枪转化水稻愈伤组织117

3.2.5　转基因植物的鉴定120

实验10　外源基因整合的鉴定——斑点杂交121

实验11　利用Southern杂交检测外源基因的整合124

实验12　植物组织总RNA的提取128

实验13　利用RT-PCR初步检测外源基因在植物体内的表达129

实验14　利用实时荧光定量RT-PCR定量检测外源基因在植物体内的表达132

实验15　gus基因检测136

主要参考文献138

第4章　动物细胞工程技术139

4.1　动物细胞工程技术原理139

4.2　动物细胞工程技术140

4.2.1　细胞培养的准备工作及基本操作140

实验1　细胞培养的前期工作140

实验2　细胞培养基的配制143

实验3　细胞计数及活力测定148

实验4　细胞传代培养（胰蛋白酶消化法）151

实验5　细胞的冻存和复苏154

4.2.2　原代细胞的培养158

实验6　从小鼠胚胎中分离鼠胚胎成纤维细胞158

实验7　从鸡胚胎中分离背根神经节细胞160

4.2.3　细胞系的建立和培养162

实验8　原代鼠胚胎成纤维细胞的永生化162

实验9　细胞系的培养164

4.2.4　DNA导入哺乳动物细胞166

实验10　与磷酸钙形成共沉淀的DNA转染技术167

实验11　脂质体介导的DNA转染技术169

实验12　用电穿孔法导入DNA172

实验13　运用显微注射法导入DNA175

4.2.5　检测基因产物的表达177

实验14　利用绿色荧光蛋白观察特定融合蛋自在细胞内的动态分布177

实验15　用免疫荧光技术检测特定蛋自质在细胞中的定位180

实验16　用免疫共沉淀法和免疫印记法检测蛋白质之间的相互作用183

实验17　用流武细胞仪分析细胞周期的交化186

实验18　利用双萤光素酶作为报告基因来检测启动子的活性和调控190

主要参考文献196

第5章　微生物工程技术197

5.1　微生物工程技术原理197

5.1.1　微生物工程的定义197

5.1.2　微生物工程的研究内容198

5.1.3　微生物工程的发展历史198

5.1.4　发酵工业的特点200

5.1.5　微生物工程的应用200

5.1.6　我国发酵工业发展概况201

5.2　微生物工程技术202

实验1　菌种的自然选育202

实验2　土壤中放线菌的选择性分离205

实验3　发酵菌株的初筛208

实验4　微生物菌种的保藏210

实验5　发酵菌种的诱变选育216

实验6 四环素的定向发酵及效价测定219

实验7　竹黄菌液体发酵及其活性物质的提取226

实验8　淀粉质原料的酒精发酵229

实验9　生长曲线和产物形成曲线的测定236

实验10　发酵过程中糖的利用238

实验11　抗生素的分离纯化240

实验12　发酵污染的检测和判断242

实验13　酸乳的发酵244

主要参考文献248