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第七章 基因的表达与调节1

第一节 概述1

第二节 原核基因的表达与调节4

1．大肠杆菌基因组结构概述4

（1）基因组结构4

（2）操纵子5

（3）基因表达信号6

2．大肠杆菌基因的转录6

（1）RNA合成的化学特性7

（2）RNA合成的不同阶段8

（3）转录终止的类型11

（4）RNA分子的类型15

3．大肠杆菌基因的转译17

（1）转译的概述17

（2）转译的三个步骤19

（3）转译的调节23

（4）mRNA稳定性的转译效应25

4．大肠杆菌基因表达的调节26

（1）转录调节的特点26

（2）大肠杆菌基因表达的诱导与阻遏27

（3）大肠杆菌基因表达的正调节与负调节28

（4）大肠杆菌基因表达的操纵子模型29

（5）弱化作用调节38

第三节 真核基因组及基因的结构41

1．染色质与染色体42

（1）染色质的组分42

（2）核小体43

（3）核小体结构的修饰44

（4）活性染色质与转录44

（5）染色体46

2．真核基因组的结构47

（1）蛋白质编码基因48

（2）遗传元件49

（3）转位子与内源性反转录病毒50

（4）卫星DNA52

（5）DNA重排52

（6）DNA扩增54

3．真核基因的结构55

（1）polⅠ基因56

（2）polⅢ基因57

（3）polⅡ基因60

第四节 真核基因的转录与调节65

1．真核RNA聚合酶与基因转录65

（1）RNA聚合酶的类型65

（2）真核mRNA的结构特征66

（3）pre-mRNA的剪辑68

（4）mRNA的稳定性68

2．真核基因启动子71

（1）启动子元件的鉴定71

（2）启动子的结构模型74

3．增强子的功能特性75

（1）增强子的一般特性75

（2）细胞专一性增强子76

（3）调节型增强子77

4．真核基因转录调节的若干问题78

（1）调节的水平78

（2）转录的控制79

（3）转录的激活80

（4）转录的抑制82

5．真核基因转录的激素调节82

（1）类固醇激素对真核基因转录的激活效应82

（2）类固醇激素激活真核基因转录的分子机理84

6．真核基因转录的甲基化调节86

（1）DNA甲基化的转录效应86

（2）甲基化作用的克隆遗传87

第五节 转录因子的结构与功能88

1．转录因子的概述88

2．转录因子的结构90

（1）转录因子的组件结构特性90

（2）DNA结合域92

（3）转录激活域96

3．转录因子的纯化与克隆97

（1）应用DNA亲和层析法纯化转录因子98

（2）应用DNA识别位点亲和层析法纯化转录因子98

（3）应用基因克隆技术纯化转录因子102

4．转录因子克隆基因的应用103

（1）阐释转录因子的特性103

（2）制备大量的转录因子蛋白质103

（3）转录因子DNA结合域定位103

（4）转录因子DNA结合域的突变研究及其基序的鉴定105

（5）转录因子激活域的鉴定——结构域交换试验105

5．转录因子的功能作用107

（1）转录因子的激活效应107

（2）转录因子的抑制效应109

第八章 真核基因在大肠杆菌中的表达112

第一节 真核基因的大肠杆菌表达体系112

1．大肠杆菌表达体系112

2．克隆基因正确表达的基本条件113

3．克隆基因表达活性的检测114

第二节 大肠杆菌的表达载体116

1．大肠杆菌表达载体的基本成分116

（1）启动子116

（2）转录终止子117

（3）转译起始序列119

（4）转译增强子119

（5）转译终止子119

2．功能启动子的分离119

（1）分离功能启动子的一般程序119

（2）使用tet r作报告基因分离功能启动子120

（3）使用galK作报告基因分离功能启动子122

3．常用的大肠杆菌表达载体126

（1）lac启动子的表达载体126

（2）trp启动子的表达载体128

（3）PL启动子的表达载体131

第三节 克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达135

1．外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位135

（1）细胞质中表达135

（2）周质中表达137

（3）胞外表达137

2．融合蛋白质的表达138

（1）融合蛋白质配偶体139

（2）表达融合蛋白质的策略139

（3）表达融合蛋白质策略的优点142

（4）融合蛋白质的纯化142

（5）融合蛋白质的切割144

3．外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性148

（1）蛋白质的酶解作用150

（2）结构决定因子与蛋白质的稳定性151

（3）表达部位与蛋白质的稳定性152

（4）表达天然的蛋白质152

（5）分子伴侣的稳定作用153

（6）大肠杆菌突变体菌株与蛋白质的稳定性154

第四节 影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素154

1．5′-UTR对克隆基因表达效率的影响155

（1）启动子结构对表达效率的影响155

（2）启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响155

（3）提高克隆基因表达效率的实验方案157

2．质粒载体的生物学特性对基因表达效率的影响158

（1）质粒载体的拷贝数对表达效率的影响158

（2）质粒载体的不稳定性对表达效率的影响161

3．mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响163

（1）转译起始序列对表达效率的影响163

（2）mRNA的稳定性对表达效率的影响164

4．遗传密码子的使用对基因表达效率的影响167

（1）密码子使用的偏爱性167

（2）密码子使用偏爱性的原因168

（3）密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响168

5．寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响169

第九章 植物基因工程171

第一节 植物基因的克隆与分离173

1．根据基因的功能分离目的基因174

2．根据mRNA特异性分离目的基因174

3．根据DNA的插入作用分离目的基因177

（1）转位子标签法177

（2）T-DNA标签法180

第二节 植物基因工程研究常用的基因183

1．选择标记基因183

（1）新霉素磷酸转移酶基因185

（2）bar基因186

2．报告基因186

（1）报告基因的应用187

（2）常用的报告基因188

3．抗虫基因191

（1）微生物源的抗虫基因192

（2）植物源的抗虫基因195

（3）动物源的抗虫基因201

4．抗病基因201

（1）抗病毒基因201

（2）抗细菌基因206

（3）抗真菌基因209

（4）植物抗病的分子机理211

5．非生物胁迫的抗性基因218

（1）重金属抗性基因218

（2）抗盐基因219

（3）抗低温胁迫基因221

（4）抗除草剂基因222

（5）抗氧化胁迫基因224

第三节 植物基因转移的病毒载体225

1．单链RNA植物病毒225

2．单链DNA植物病毒227

（1）双子座病毒组病毒的一般生物学特性227

（2）番茄金色花叶病毒作为植物基因转移载体的可能性228

3．双链DNA植物病毒229

（1）花椰菜花叶病毒组的一般生物学特性231

（2）CaMV DNA的特性232

（3）CaMV的生活史模式233

4．花椰菜花叶病毒DNA载体234

（1）CaMV DNA的表达235

（2）DNA的缺失或插入与CaMV的感染性235

（3）CaMV克隆载体的发展236

（4）CaMV DNA作为克隆载体的评价237

第四节 植物基因转移的质粒载体238

1．病原土壤杆菌238

2．植物冠瘿的诱发与冠瘿细胞的特性240

3．Ti质粒的遗传特性241

（1）冠瘿瘤诱发之遗传本质241

（2）Ti质粒的遗传功能244

（3）以Ti质粒为媒介的接合转移245

（4）Ti质粒的限制图及基因图246

4．T-DNA的结构与功能247

（1）Ti质粒与T-DNA247

（2）T-DNA的整合机理247

（3）T-DNA的编码基因及功能250

5．Ti质粒载体的构建251

（1）T-DNA转化的选择记号251

（2）共合载体法252

（3）双元载体系统255

（4）隔端载体法257

6．Ri质粒载体系统260

第五节 培育转基因植物的实验方法261

1．根瘤土壤杆菌的转化261

（1）两步接合转移法262

（2）三亲株杂交转移法262

2．植物细胞的转化263

（1）根瘤土壤杆菌介导的植物细胞转化法263

（2）生物弹击法271

（3）其它方法271

3．转基因植株的再生273

（1）愈伤组织培养274

（2）原生质体培养274

第六节 转基因植物中外源基因的表达与调节278

1．高等植物基因表达调节概述278

（1）高等植物基因表达的类型278

（2）叶绿体基因的表达与调节279

（3）花发育过程中基因的表达与调节281

（4）植物激素与发育调节281

2．转基因沉默及其机理282

（1）转基因沉默的分子机理283

（2）转基因沉默的模式285

（3）DNA甲基化与转基因沉默286

（4）基质附着区的功能286

3．环境因素对转基因表达活性的影响287

4．提高转基因表达水平的若干技术途径287

（1）启动子及终止子的修饰与改造287

（2）转基因的修饰与改造288

（3）使用植物偏爱的密码子289

（4）蛋白质的定向运输290

第十章 哺乳动物基因工程291

第一节 哺乳动物基因转移的遗传选择标记291

1．嘌呤和嘧啶的生物合成291

2．胸苷激酶基因选择系统293

（1）TK-细胞293

（2）HAT选择法293

（3）共转化选择294

3．二氢叶酸还原酶基因选择系统296

（1）基本原理296

（2）主要优点297

（3）显性选择298

4．氯霉素乙酰转移酶基因选择系统298

（1）CAT质粒载体298

（2）CAT酶活性的测定299

5．黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因选择系统299

（1）基本原理299

（2）pSV2及其派生的质粒载体301

（3）pRSV及其派生的质粒载体303

6．氨基糖苷磷酸转移酶基因选择系统303

第二节 外源DNA导入哺乳动物细胞的方法305

1．磷酸钙转染技术305

（1）磷酸钙转染的基本步骤305

（2）影响磷酸钙转染效率的因素305

2．DEAE-葡聚糖转染技术308

（1）DEAE-葡聚糖转染的一般程序308

（2）DEAE-葡聚糖转染的可能机理及影响因素308

（3）DEAE-葡聚糖转染法的评价308

3．聚阳离子-DMSO转染技术309

4．基因显微注射技术309

（1）显微注射法309

（2）穿刺法310

5．电穿孔DNA转移技术310

（1）基本原理310

（2）操作程序310

（3）影响因素311

6．脂质体载体法311

（1）脂质体的制备312

（2）脂质转染法312

（3）脂质体载体法的优越性312

7．哺乳动物细胞基因打靶314

（1）基因打靶的分子基础314

（2）基因打靶的类型与应用315

（3）正负选择法316

（4）一触即脱选择法318

（5）哺乳动物细胞基因剔除实验318

第三节 SV40病毒载体320

1．SV40病毒的基本生物学特性321

（1）SV40病毒的生命周期321

（2）SV40病毒的基础分子生物学322

（3）SV40病毒的增强子序列323

2．取代型重组病毒载体323

（1）晚期区段取代载体324

（2）早期区段取代载体328

3．重组的病毒-质粒载体329

（1）含有完整早期区段和复制起点的病毒-质粒载体329

（2）微型病毒复制子-质粒载体330

第四节 反转录病毒载体331

1．反转录病毒的一般生物学特性332

（1）生命周期332

（2）反转录病毒基因组的特点333

（3）反转录病毒的复制335

（4）原病毒DNA的表达336

2．反转录病毒载体的主要类型338

（1）辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体338

（2）不需要辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体339

（3）广寄主的反转录病毒载体342

（4）反转录病毒表达载体342

第五节 其它的病毒载体344

1．痘苗病毒载体344

（1）痘苗病毒的特性344

（2）痘苗病毒载体的构建344

2．乳头瘤病毒载体346

（1）牛乳头瘤病毒基因组的结构特点347

（2）牛乳头瘤病毒载体347

3．腺病毒载体349

（1）腺病毒的一般生物学特性350

（2）腺病毒载体的构建351

第十一章 重组DNA与现代生物技术352

第一节 若干重大农业生产问题的探索352

1．提高光合作用效率的基因工程基础研究352

（1）光合作用概述352

（2）光合作用基因工程的主要目标354

（3）叶绿体基因组的转化356

2．生物固氮与固氮基因转移360

（1）根瘤菌的固氮作用360

（2）固氮酶复合体363

（3）生物固氮的基因工程364

3．农作物产品质量的修饰365

（1）改善脂肪酸的质量365

（2）提高种子蛋白的营养价值367

（3）延迟水果的成熟期369

（4）修饰淀粉的成分371

第二节 重组DNA技术与药品制造业373

1．重组疫苗374

（1）疫苗的设计375

（2）重组亚基疫苗375

（3）重组病毒活疫苗377

2．抑生长素379

（1）抑生长素基因的化学合成380

（2）抑生长素基因的克隆策略380

（3）克隆抑生长素基因的意义383

3．胰岛素384

（1）合成重组人胰岛素的第一种策略386

（2）合成重组人胰岛素的第二种策略388

4．干扰素389

（1）淋巴因子389

（2）人干扰素的功能及其作用的分子机理390

（3）人干扰素的基因工程391

5．人生长激素392

（1）人生长激素的生理功能392

（2）重组人生长激素的生产394

（3）重组人生长激素的改良396

第三节 重组DNA技术在工业生产中的应用396

1．纤维素的开发利用396

（1）纤维素的生物降解397

（2）纤维素酶基因的分离398

（3）纤维素酶基因工程400

2．食品工业401

（1）乳制品发酵401

（2）单细胞蛋白质402

（3）酿酒工业403

3．新型抗菌素的生产404

（1）聚酮类抗菌素的合成405

（2）新型抗菌素的合成406

（3）聚酮类抗菌素的突变改造407

第四节 蛋白质工程407

1．生产新型蛋白质的途径407

（1）应用化学合成和修饰法生产工程蛋白质408

（2）应用化学合成的DNA序列表达工程蛋白质408

（3）应用基因定点诱变技术生产新型蛋白质408

（4）应用随机诱变技术生产新型蛋白质410

（5）应用蛋白质连接酶生产新型蛋白质411

2．蛋白酶工程411

（1）组织纤溶酶原激活物的定点改造411

（2）α1-抗胰蛋白酶的定点改造412

（3）枯草蛋白酶的定点改造413

3．抗体工程414

（1）抗体特异性的分子基础414

（2）单克隆抗体416

（3）重组的单克隆抗体418

（4）人源化的单克隆抗体421

（5）双特异性的单克隆抗体423

第五节 环境生物技术学423

1．塑料污染的生物防治424

（1）生物降解塑料424

（2）应用转基因植物生产生物降解塑料426

2．农药污染的生物防治429

（1）五氯苯酚污染的生物防治430

（2）除草剂污染的生物防治431

（3）有机磷污染的生物防治432

3．石油污染的生物防治435

第十二章 重组DNA与医学研究438

第一节 癌症研究438

1．癌基因438

（1）病毒癌基因438

（2）细胞癌基因441

2．肿瘤抑制基因443

（1）存在肿瘤抑制基因的实验证据443

（2）肿瘤抑制基因的功能作用444

（3）p53肿瘤抑制基因445

（4）RB1肿瘤抑制基因446

3．细胞癌化446

（1）蛋白质激酶447

（2）ras族癌基因448

（3）myc族癌基因448

4．癌症的基因治疗449

（1）转录因子诱捕法449

（2）RNA转染法450

（3）自杀基因治疗法450

（4）肿瘤抑制基因治疗法450

（5）反义基因阻断治疗法450

第二节 艾滋病研究450

1．艾滋病与HIV病毒450

（1）HIV病毒的起源451

（2）HIV病毒的变异性452

（3）HIV病毒的感染与治疗453

2．HIV-1病毒基因组的结构455

（1）tat基因456

（2）rev基因457

（3）nef基因459

（4）其它基因460

3．HIV疫苗的研制460

（1）制约HIV疫苗研制的困难因素460

（2）HIV疫苗研制的现状461

（3）展望463

第三节 遗传性疾病的基因诊断与治疗464

1．遗传与疾病464

2．遗传性疾病的基因诊断465

（1）遗传性疾病的核酸探针检测法465

（2）遗传性疾病的产前诊断466

（3）胎儿的DNA分析467

3．遗传性疾病的基因治疗468

（1）基因治疗的转基因载体468

（2）基因打靶与基因治疗470

（3）基因治疗的若干病例471

第四节 DNA疫苗474

1．DNA疫苗的概述474

（1）DNA疫苗的构成474

（2）DNA疫苗的作用机理475

（3）DNA疫苗的优越性475

2．DNA疫苗的优化476

（1）DNA载体的优化476

（2）抗原编码序列的优化478

（3）免疫佐剂的应用478

3．DNA疫苗的导入方式479

（1）基因枪法479

（2）脂质体法479

（3）减毒有机体法480

4．DNA疫苗的安全性480

5．结论481

附录 名词术语解释482

参考文献506

索引519

后记536