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1概述3

1.1基因工程的基本概念3

1.1.1基因工程的基本定义3

1.1.2基因工程的基本过程3

1.1.3基因工程的基本原理3

1.1.4基因工程的基本体系4

1.2基因工程的发展历史6

1.2.1基因工程的诞生6

1.2.2基因工程的成熟7

1.2.3基因工程的腾飞8

1.3基因工程的研究意义8

1.3.1第四次工业大革命8

1.3.2第二次农业大革命9

1.3.3第四次医学大革命10

2 DNA重组克隆单元操作13

2.1 DNA重组的载体13

2.1.1质粒载体13

2.1.2 λ双链噬菌体DNA载体18

2.1.3 M13单链噬菌体DNA载体23

2.1.4噬菌体质粒杂合载体25

2.1.5人造染色体载体27

2.2 DNA的体外重组（切与接）27

2.2.1限制性核酸内切酶28

2.2.2 T4-DNA连接酶33

2.2.3其他用于DNA重组的工具酶35

2.2.4 DNA切接反应的影响因素38

2.2.5 DNA分子重组的方法41

2.3重组DNA分子的转化与扩增（转与增）50

2.3.1重组DNA转化的基本概念50

2.3.2受体细胞的选择51

2.3.3转化方法53

2.3.4转化率及其影响因素56

2.3.5转化细胞的扩增58

2.4转化子的筛选与重组子的鉴定（检）58

2.4.1基于载体遗传标记的筛选与鉴定58

2.4.2基于克隆片段序列的筛选与鉴定61

2.4.3基于外源基因表达产物的筛选与鉴定75

2.5目的基因的克隆77

2.5.1鸟枪法78

2.5.2 cDNA法81

2.5.3 PCR扩增法89

2.5.4化学合成法95

2.5.5基因文库的构建98

3大肠杆菌基因工程107

3.1外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理107

3.1.1启动子107

3.1.2终止子112

3.1.3 SD序列112

3.1.4密码子113

3.1.5质粒拷贝数115

3.2大肠杆菌工程菌的构建策略116

3.2.1包含体型异源蛋白的表达117

3.2.2分泌型异源蛋白的表达120

3.2.3融合型异源蛋白的表达124

3.2.4寡聚型异源蛋白的表达129

3.2.5整合型异源蛋白的表达132

3.2.6蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建133

3.3重组异源蛋白的体外复性活化136

3.3.1包含体的溶解与变性136

3.3.2异源蛋白的复性与重折叠138

3.4大肠杆菌工程菌培养的最优化控制142

3.4.1细菌生长的动力学原理143

3.4.2发酵过程的最优化控制145

3.4.3大肠杆菌工程菌的高密度发酵148

3.5基因工程菌的遗传不稳定性及其对策150

3.5.1工程菌遗传不稳定性的表现与机制150

3.5.2改善工程菌不稳定性的对策152

3.6利用重组大肠杆菌生产人胰岛素154

3.6.1胰岛素的结构及其生物合成155

3.6.2人胰岛素的生产方法156

3.6.3产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略156

4酵母基因工程163

4.1酵母的受体系统163

4.1.1提高重组异源蛋白产率的突变型受体163

4.1.2抑制超糖基化作用的突变型受体164

4.1.3减少泛素依赖型蛋白质降解作用的突变型受体165

4.1.4内源性蛋白酶缺陷型的突变型受体166

4.2酵母的载体系统166

4.2.1酿酒酵母中的2μ环状质粒166

4.2.2乳酸克鲁维酵母中的线状质粒167

4.2.3果蝇克鲁维酵母中的环状质粒168

4.2.4含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建168

4.2.5含有CEN的YCp载体及其构建169

4.2.6含有TEL的YAC载体及其构建170

4.3酵母的转化系统172

4.3.1酵母的转化程序172

4.3.2转化质粒在宿主细胞中的命运173

4.3.3用于转化子筛选的标记基因174

4.4酵母的表达系统176

4.4.1酵母启动子的基本特征与选择176

4.4.2酵母启动子的可调控表达系统177

4.4.3外源基因在酵母中表达的限制性因素179

4.4.4酵母表达系统的选择180

4.5酵母的蛋白质修饰分泌系统184

4.5.1酵母的蛋白质分泌运输机制184

4.5.2酵母的信号肽及其剪切系统185

4.5.3酵母分泌型蛋白的糖基化修饰187

4.6利用重组酵母生产乙肝疫苗189

4.6.1乙肝病毒的结构189

4.6.2产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母的构建190

4.6.3产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母的构建191

4.7利用重组酵母生产人血清清蛋白192

5高等动物基因工程197

5.1动物转基因技术的基本概念197

5.1.1动物转基因的效率197

5.1.2动物转基因的结构197

5.1.3动物转基因的表达特性198

5.1.4动物转基因的生物学效应199

5.2转基因导入动物体内的方法199

5.2.1转基因的动物受体细胞系统199

5.2.2动物细胞物理转化法201

5.2.3动物病毒转染法202

5.2.4工程胚胎干细胞法207

5.2.5体细胞转基因克隆法209

5.3利用动物转基因技术研究基因的表达与功能209

5.3.1利用转报告基因探测动物基因组中的调控序列210

5.3.2利用同源基因灭活细胞内源基因212

5.3.3利用CreloxP系统条件性敲除基因213

5.3.4利用CRISPRCas系统条件性敲除基因214

5.3.5利用反义基因抑制细胞基因表达215

5.3.6利用干扰RNA阻断特定基因表达217

5.4利用转基因动物或细胞生产生物大分子217

5.4.1动物细胞高效表达异源蛋白的基本原理217

5.4.2利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产结构复杂的人体蛋白219

5.4.3利用动物乳腺组织生产蛋白药物220

5.5转基因技术在动物遗传性状改良中的应用222

5.5.1转基因鼠222

5.5.2转基因兔、猪、羊223

5.5.3转基因牛224

5.5.4转基因鸡224

5.5.5转基因鱼224

5.6基因治疗225

5.6.1基因治疗的基本战略思想225

5.6.2肿瘤的基因治疗227

5.6.3囊性纤维变性症的基因治疗230

5.6.4杜兴肌营养不良症的基因治疗231

5.6.5重度联合免疫缺陷症的基因治疗231

5.6.6糖尿病的基因治疗战略232

5.6.7骨髓细胞的转基因研究232

5.6.8基因治疗的副反应及其对策233

6高等植物基因工程237

6.1高等植物的遗传学特性237

6.2高等植物的基因转移系统238

6.2.1 Ti质粒介导的整合转化系统238

6.2.2植物病毒介导的转染系统243

6.2.3植物细胞的直接转化方法247

6.2.4植物原生质体的再生249

6.3高等植物的基因表达系统249

6.3.1外源基因的四环素诱导系统250

6.3.2外源基因的乙醇诱导系统252

6.3.3外源基因的类固醇诱导系统253

6.3.4外源基因的地塞米松诱导和四环素抑制系统255

6.4利用植物转基因技术研究基因的表达与调控255

6.4.1利用报告基因展示高等植物基因表达与调控的信息谱255

6.4.2利用病毒载体探查植物基因重排256

6.4.3利用转座元件克隆植物基因256

6.4.4利用T-DNA构建植物遗传突变株257

6.5利用转基因植物生产重组异源蛋白和工业原料257

6.5.1利用植物生物反应器生产医用蛋白257

6.5.2利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂259

6.5.3利用植物生物反应器生产工业原料259

6.6转基因技术在植物品种改良中的应用260

6.6.1控制果实成熟的转基因植物260

6.6.2抗虫害的转基因植物261

6.6.3抗病原体的转基因植物262

6.6.4抗除草剂的转基因植物263

6.6.5改变花型花色的转基因植物264

6.6.6抗环境压力的转基因植物264

6.6.7产生高品质产物的转基因植物265

6.6.8转基因植物的安全性266

7第二代基因工程——蛋白质工程269

7.1蛋白质工程的基本概念269

7.1.1蛋白质工程的基本特征269

7.1.2蛋白质工程的研究内容及应用270

7.1.3蛋白质工程实施的必要条件271

7.2基因的体外定向突变271

7.2.1局部随机掺入法271

7.2.2碱基定点转换法272

7.2.3部分片段合成法274

7.2.4引物定点引入法275

7.2.5 PCR扩增突变法277

7.3基因的体外定向进化279

7.3.1易错PCR279

7.3.2 DNA改组279

7.3.3体外随机引发重组281

7.3.4交错延伸282

7.3.5过渡模板随机嵌合生长283

7.3.6渐增切割杂合酶生成284

7.3.7同源序列非依赖性蛋白质重组285

7.3.8突变文库的筛选模型285

7.4蛋白质工程的设计思想与应用287

7.4.1提高蛋白质或酶的稳定性287

7.4.2减少重组多肽链的错误折叠290

7.4.3改善酶的催化活性291

7.4.4消除酶的被抑制特性293

7.4.5修饰酶的催化特异性293

7.4.6强化配体与其受体的亲和性296

7.4.7降低异源蛋白药物的免疫原性296

8第三代基因工程——途径工程303

8.1途径工程的基本概念303

8.1.1途径工程的基本定义303

8.1.2途径工程的基本过程304

8.1.3途径工程的基本原理307

8.2途径工程的研究战略307

8.2.1在现存途径中提高目标产物的代谢流308

8.2.2在现存途径中改变物质流的性质311

8.2.3利用已有途径构建新的代谢旁路312

8.3初级代谢的途径工程314

8.3.1乙醇生产菌的途径操作314

8.3.2辅酶Q生产菌的途径操作321

8.3.3氢气生产菌的途径操作328

8.4次级代谢的途径工程329

8.4.1聚酮生物合成的分子机制329

8.4.2聚酮合酶各组成模件的操作战略330

8.4.3聚酮生物合成基因的异源表达333