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目录1

第一章蛋白质的分离纯化1

第一节蛋白质分离纯化的一般原则1

一、蛋白质分离纯化技术及其依据1

二、蛋白质纯化的一般设计原则2

第二节蛋白质的层析分离2

一、层析技术的发展简史及科学意义2

二、层析技术的基本原理3

三、离子交换层析5

四、凝胶过滤层析9

五、亲和层析11

六、其它层析技术14

第三节 蛋白质的电泳分离15

一、电泳发展简史及科学意义16

二、电泳技术的基本原理16

三、电泳技术的分类17

四、聚丙烯酰胺凝胶电泳概述17

五、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳19

六、等电聚焦电泳22

七、毛细管电泳25

第四节蛋白质的浓缩25

一、超滤法25

二、冷冻干燥法26

三、吸收法26

四、沉淀法26

——血清白蛋白、γ－球蛋白的分离纯化及鉴定28

第五节蛋白质纯化及鉴定的教学实验举例28

第二章蛋白质的定性定量分析33

第一节蛋白质的含量测定33

一、凯氏定氮法33

二、Lowry法34

三、紫外光谱吸收法36

四、考马斯亮蓝G-250染色法37

五、二喹啉甲酸检测法38

一、SDS-PAGE法测定蛋白质的相对分子量39

第二节 蛋白质相对分子量的测定39

二、凝胶过滤层析法测定蛋白质相对分子量40

第三节等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点42

一、等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理42

二、等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作42

第四节其它蛋白质定性定量分析技术44

一、蛋白质的电泳染色定量44

二、免疫印迹法分析特定蛋白质的相对含量44

三、其它测定特定蛋白质含量的方法52

第三章蛋白质一级结构的测定53

第一节蛋白质一级结构测定的历史及测定策略53

一、蛋白质一级结构测定的历史53

二、蛋白质一级结构的测定策略54

第二节蛋白质的氨基酸组成分析54

一、水解54

二、衍生54

第三节多肽链的末端分析55

三、分离及检测55

一、N端分析56

二、C端分析56

第四节肽段的氨基酸序列分析56

一、肽链降解成肽段56

二、肽段一级的结构测定57

第五节二硫键、酰胺基、磷酸化及糖基化修饰定位59

一、蛋白质分子中二硫键的定位59

二、酰胺基及其它修饰氨基酸残基的定位60

第四章蛋白质的空间结构分析61

第一节蛋白质的二级结构分析61

一、圆二色光谱法62

二、傅里叶变换红外光谱法63

第二节X线衍射法分析蛋白质的晶体空间结构63

一、基本原理64

二、晶体结构解析过程64

第三节 核磁共振技术分析蛋白质的液相空间结构66

一、基本原理67

二、主要方法69

三、蛋白质空间结构的测定72

第四节 蛋白质空间结构的预则75

第五节蛋白质空间结构的预测工具简介75

第五章DNA体外重组技术80

第一节DNA体外重组载体的种类和选择80

一、载体的分类81

二、不同载体的特点和分类81

二、DNA聚合酶84

第二节基因工程中常用的工具酶84

一、限制性核酸内切酶84

三、DNA连接酶85

四、其它DNA修饰酶85

第三节 目的基因的获得和修饰85

一、采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因85

二、采用PCR或RT-PCR方法制备目的基因86

三、基因组文库或cDNA文库的构建和筛选86

一、PCR产物的克隆策略87

四、化学合成法制备基因片段87

第四节 目的基因和载体的连接87

二、外源DNA片段和载体的连接88

第五节重组分子的扩增和鉴定88

一、重组DNA分子导入受体细胞88

二、重组DNA分子的鉴定89

第六节基因体外重组实验举例90

第六章核酸分子杂交94

第一节核酸探针及其标记94

一、核酸标记物及其选择94

二、核酸探针的标记方法96

三、标记探针的纯化100

第二节核酸分子杂交的种类和方法101

一、固相支持物与印迹方法的选择101

二、Southern印迹杂交103

三、Northern杂交106

五、原位杂交109

四、斑点杂交与狭缝杂交109

第七章聚合酶链反应（PCR）技术111

第一节 PCR的反应体系112

一、寡核苷酸引物112

二、缓冲液112

三、DNA聚合酶112

四、脱氧核苷三磷酸113

五、模板DNA114

第二节PCR引物的设计114

第三节PCR的基本操作步骤及条件优化115

一、基本操作步骤115

二、条件优化115

第四节PCR衍生技术117

第五节PCR技术的应用123

一、基因分析123

一、RT-PCR125

第六节PCR实验举例125

二、定位克隆125

三、序列分析125

二、重组PCR126

第八章DNA序列分析技术129

第一节DNA序列测定的原理和技术129

一、DNA测序原理129

二、DNA测序策略130

三、DNA测序的常用技术131

一、自动激光荧光DNA测序原理132

第二节全自动激光荧光DNA测序132

二、自动激光荧光DNA测序注意事项133

三、自动激光荧光DNA测序程序134

第九章外源基因的原核表达139

第一节原核表达系统常用的载体及其应用139

一、大肠杆菌表达系统139

二、芽孢杆菌表达系统141

三、链霉菌表达系统142

一、蛋白质在原核细胞中的表达特点143

第二节外源基因的表达和鉴定143

二、包含体的形成、变性与复性144

三、蛋白质在原核细胞中表达的调控145

四、外源基因在原核细胞中表达的鉴定146

第三节 外源基因表达条件的优化147

一、表达载体的优化设计与选择147

二、增加mRNA的稳定性148

三、提高外源蛋白的稳定性148

四、工程化宿主菌的选择149

第四节 外源基因原核表达的基本操作方法与步骤149

一、获得目的基因并克隆入原核表达载体150

二、rhTNFa工程菌的建立150

三、rhTNFa的表达和鉴定151

四、rhTNFa样品的鉴定151

第一节概述153

一、真核细胞表达宿主的种类及各自优势153

第十章外源基因在真核细胞中的表达153

二、真核细胞表达外源基因的意义154

三、外源基因导入真核细胞的基本方法154

四、外源基因在真核细胞中表达的主要方式154

五、外源基因在真核细胞中表达产物的鉴定和纯化155

第二节 外源基因在哺乳动物细胞中的表达155

一、哺乳动物细胞表达载体155

二、常用的哺乳动物细胞的种类161

三、哺乳动物细胞的基因导入方法162

第三节 外源基因在酵母细胞中的表达164

一、酵母细胞表达载体164

二、酵母细胞培养的基本技术及外源基因的导入方法166

第四节 外源基因在昆虫细胞中的表达168

一、用于昆虫细胞蛋白表达的载体或载体系统168

二、常用的昆虫细胞株170

三、杆状病毒进行蛋白质表达的程序170

二、基因体外转录的基本原理173

一、基因体外转录的目的和意义173

第一节基因的体外转录173

第十一章基因的体外转录和翻译173

三、基因体外转录的基本实验流程174

第二节 基因的体外翻译177

一、基因体外翻译的目的和意义177

二、基因体外翻译的基本原理177

三、基因体外翻译的基本实验流程178

四、基因体外翻译实验中常遇到的问题180

五、基因体外翻译方法的选择181

第十二章基因文库182

第一节基因组DNA文库182

一、基因组DNA文库的概念及应用182

二、基因组DNA文库的完整性与代表性182

三、构建基因组DNA文库的载体系统183

四、基因组DNA文库的构建184

五、基因组DNA文库的筛选187

一、概述190

第二节 cDNA文库190

二、cDNA文库的构建191

三、cDNA文库的筛选197

第十三章遗传修饰动物模型199

第一节转基因动物的概念及其发展简史199

第二节研制转基因动物的基本步骤199

一、转基因载体的构建及制备199

二、转基因方法200

三、转基因动物的检测201

第三节建立基因打靶动物模型的策略202

一、研制基因打靶小鼠的策略204

二、ES细胞相关操作技术209

三、基因打靶小鼠的研究实例-Smad5基因剔除小鼠的建立和鉴定210

第四节遗传修饰动物模型在生物医学研究中的应用前景214

第十四章生物芯片技术216

第一节概述216

一、生物芯片的概念216

二、DNA芯片217

一、原位合成DNA芯片的制作218

第二节生物芯片的制作218

二、DNA微集阵列芯片的制作219

第三节DNA芯片使用的基本流程221

一、待测样品的准备221

二、分子杂交反应222

三、检测分析222

第四节蛋白质芯片223

一、DNA芯片与基因表达谱研究224

第五节 生物芯片的基本操作及应用224

二、DNA测序229

三、基因突变检测230

四、基因诊断231

五、蛋白质芯片的应用233

六、药物研发233

第十五章人类基因组学相关技术235

第一节 人类基因组计划的主要研究内容及进展235

一、遗传图谱235

二、物理图谱236

四、转录图谱237

三、序列图谱237

第二节 人类基因组计划在医学中的意义238

一、基因结构与功能的研究238

二、基因组信息与疾病易感性的研究238

三、基因组与癌症研究239

四、疾病的遗传学背景239

五、药物基因组学240

二、NCBI基因组数据库的应用241

第三节 人类基因组计划数据的利用241

一、主要相关数据库241

三、利用基因组数据信息发现新基因244

四、其它检索系统244

第十六章蛋白质组学研究技术246

第一节概述246

一、蛋白质组学的产生246

二、蛋白质组学的概念246

三、蛋白质组学研究的意义247

第二节蛋白质组学研究的技术体系248

一、双向电泳249

二、生物质谱与蛋白质鉴定253

三、翻译后修饰蛋白质的鉴定257

四、蛋白质组数据库260

第三节蛋白质组学的应用262

第一节概述263

一、研究差异表达基因的目的和意义263

第十七章研究差异表达基因的相关技术263

二、研究差异表达基因的主要方法264

第二节 基于PCR的消减杂交技术269

一、基本原理269

二、实验流程269

三、实验方法271

四、结果与分析273

五、对所获基因作进一步研究的思路276

六、方法学讨论和注意事项276

一、酵母双杂交系统的建立和基本原理278

第十八章用酵母双杂交系统研究蛋白质－蛋白质相互作用278

第一节酵母双杂交系统简介278

二、酵母双杂交系统的基本策略280

三、酵母双杂交系统的优点280

四、酵母双杂交技术的应用现状280

五、酵母双杂交系统中常见问题的解决与改进措施281

六、酵母双杂交系统使用注意事项282

七、逆双杂交系统和三杂交技术283

二、实验流程284

三、实验方法284

一、基本材料和试剂284

第二节酵母双杂交的实验过程284

第三节酵母双杂交实验实例结果和讨论289

第十九章新基因功能研究的策略294

第一节 从蛋白质产物功能和基因表达规律研究基因的功能294

第二节抑制基因表达或除去基因298

附录一分子生物学实验常用参数300

附录二常用试剂的配制308