医学分子生物学实验技术 第2版PDF|Epub|txt|kindle电子书版本网盘下载

医学分子生物学实验技术 第2版PDF格式电子书版下载

注意：本站所有压缩包均有解压码： 点击下载压缩包解压工具

绪论1

一、分子生物学技术的历史和意义1

二、医学分子生物学实验设计思路3

三、分子生物学实验实施6

第一章 聚合酶链反应9

第一节PCR技术概述9

一、PCR技术的建立和基本原理9

二、PCR的反应体系10

三、PCR反应基本步骤12

第二节PCR的引物设计和条件优化12

一、PCR引物的设计12

二、PCR反应条件的优化13

第三节PCR产物的鉴定方法14

第四节PCR的基本类型及应用16

一、PCR技术的主要类型16

二、PCR技术的用途23

第五节 实时定量PCR25

一、实时定量PCR技术的原理25

二、应用于实时定量PCR中的荧光探针与荧光染料26

三、实时定量PCR的实验流程29

四、实时定量PCR常见问题及优化方案29

五、实时定量PCR技术在医学上的应用30

第二章DNA体外重组33

第一节DNA体外重组的基本流程33

一、基本流程33

二、关键工具酶33

第二节 载体的选择及准备37

一、载体及其基本特性37

二、载体图谱40

三、载体的选择41

第三节 目的DNA片段的获取43

一、获取DNA片段的方法选择43

二、DNA片段末端的处理45

第四节DNA片段与载体的连接45

一、DNA片段与载体的连接方式45

二、连接反应时需要考虑的一些因素47

三、平端连接条件的优化48

第五节 重组DNA转化宿主细胞49

一、宿主细胞的选择49

二、大肠埃希菌感受态制备51

三、重组DNA分子转化大肠埃希菌51

第六节 重组DNA的克隆筛选及鉴定52

第三章DNA序列分析技术55

第一节 常规DNA序列测定的原理55

一、双脱氧测序法的原理56

二、Maxam-Gilbert化学降解法测序原理56

三、常规DNA测序的用途57

第二节 自动激光荧光DNA测序——第一代测序技术58

一、自动激光荧光DNA测序基本原理58

二、自动激光荧光DNA测序程序60

三、自动激光荧光DNA测序注意事项62

第三节 其他DNA序列分析新技术64

一、焦磷酸测序法64

二、第二代测序技术——循环芯片测序法65

三、第三代测序技术——单分子测序技术68

第四章 基因突变技术72

第一节 体外基因突变和鉴定72

一、体外基因突变的原理和应用72

二、体外基因突变的策略和步骤73

第二节 细胞和动物的基因诱变和鉴定77

一、利用ENU进行大规模基因诱变77

二、利用转座子进行大规模基因诱变79

第五章 核酸分子杂交83

第一节 核酸探针及其标记83

一、探针的种类及其选择83

二、核酸标记物及其选择84

三、核酸探针的标记方法86

四、标记探针的纯化90

第二节Southern印迹杂交91

一、固相支持物与印迹方法的选择91

二、Southern印迹杂交基本过程93

三、Southern印迹杂交的注意事项95

第三节Northern印迹杂交96

一、Northern印迹杂交基本过程96

二、Northern印迹杂交注意事项97

第四节 其他核酸分子杂交98

一、斑点杂交与狭缝印迹杂交98

二、原位杂交99

三、液相分子杂交101

第六章 外源基因在原核细胞的表达104

第一节 常用表达系统及其选择104

一、大肠埃希菌表达系统104

二、芽胞杆菌表达系统108

三、链霉菌表达系统108

第二节 外源基因的表达和鉴定109

一、蛋白质在原核细胞中的表达特点109

二、包涵体的形成、变性与复性110

三、蛋白质在原核细胞表达的调控111

四、外源基因在原核细胞中表达的鉴定112

第三节 外源基因表达条件和优化112

一、表达载体的优化设计与选择112

二、增加mRNA的稳定性113

三、提高外源蛋白的稳定性113

四、选择合适的宿主菌114

第四节 外源基因原核表达的基本操作114

一、获得目的基因并克隆入原核表达载体115

二、工程菌的构建115

三、产物的表达与鉴定116

四、样品的检定116

第七章 外源基因在真核细胞中的表达118

第一节 真核表达载体及宿主118

一、常用表达系统及其特点118

二、外源基因在真核细胞中表达的主要方式118

三、外源基因在真核细胞中表达的鉴定119

第二节 真核细胞基因导入方法119

一、物理方法119

二、化学方法119

三、病毒感染法120

第三节 外源基因在酵母细胞中的表达120

一、常用的酵母细胞表达载体120

二、酵母细胞表达外源蛋白质的主要方法121

第四节外源基因在昆虫细胞中的表达123

一、常用的昆虫表达系统124

二、昆虫细胞表达外源蛋白质的主要方法124

第五节外源基因在哺乳动物细胞中的表达125

一、常用的哺乳动物细胞表达载体126

二、哺乳动物细胞表达外源蛋白质的主要方法128

第八章 蛋白质的分离纯化131

第一节 蛋白质分离纯化的基本原则131

第二节生物样品的预处理133

一、机械破碎法133

二、超声振荡法133

三、反复冻融法133

四、表面活性剂裂解及酶解法133

第三节 蛋白质样品的粗分离134

一、离心分离134

二、透析和超滤135

三、沉淀136

第四节 蛋白质的层析纯化137

一、凝胶过滤层析137

二、离子交换层析140

三、亲和层析纯化143

四、疏水作用层析145

第五节 蛋白质的电泳分离和鉴定147

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳147

二、等电聚焦电泳149

三、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳151

第六节 纯化蛋白质的后期处理151

一、纯化蛋白质的复性151

二、纯化蛋白质的脱盐和浓缩152

三、纯化蛋白质的干燥和保存153

第七节 蛋白质分离纯化的综合策略153

一、基于纯化目的的策略153

二、基于原料来源的策略153

三、基于重组蛋白的纯化策略154

第九章 蛋白质的定性定量分析156

第一节 蛋白质分子量的测定156

一、SDS-PAGE法测定蛋白质的相对分子量156

二、凝胶过滤层析法测定蛋白质相对分子量158

三、质谱法测定蛋白质精确分子量159

第二节 蛋白质的等电点测定160

一、等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理160

二、等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作160

第三节 蛋白质总含量测定161

一、凯氏定氮法162

二、Lowry法162

三、二喹啉甲酸法164

四、考马斯亮蓝法165

五、紫外光谱吸收法165

六、其他方法166

第四节 特定蛋白质的含量测定167

一、细胞可溶性蛋白的含量测定167

二、细胞分泌蛋白的含量测定175

三、膜蛋白的含量测定177

第五节 蛋白质半衰期测定178

一、脉冲追踪标记法178

二、放线菌酮阻断法180

第十章 蛋白的化学修饰分析182

第一节 蛋白磷酸化分析182

一、放射性核素示踪法用于蛋白磷酸化分析183

二、抗磷酸化氨基酸抗体用于蛋白磷酸化分析187

三、蛋白磷酸化的规模化分析188

第二节 蛋白糖基化分析189

一、酶解释放法鉴定糖蛋白190

二、糖基化抑制剂用于鉴定糖蛋白192

三、凝集素结合法鉴定糖蛋白193

四、单糖放射性核素示踪法194

第三节 其他蛋白共价修饰分析194

一、蛋白泛素化分析194

二、组蛋白的乙酰化和甲基化分析197

第十一章 蛋白质的空间结构分析199

第一节 蛋白质的一级结构分析199

一、Edman降解法测序199

二、质谱测序200

第二节 蛋白质的二级结构分析201

一、圆二色光谱201

二、傅里叶变换红外光谱202

第三节 蛋白质的晶体空间结构解析202

一、基本原理203

二、晶体结构解析过程204

第四节 蛋白质的液相空间结构解析205

一、蛋白质样品的准备206

二、NMR实验及蛋白质化学位移指认207

三、蛋白质溶液结构计算208

第五节 蛋白质空间结构的预测210

一、蛋白质二级结构预测210

二、蛋白质三级结构预测211

第六节 蛋白质的分子结构对接212

一、蛋白质分子对接软件简介212

二、蛋白质分子对接软件应用示例212

第十二章 蛋白质相互作用研究技术216

第一节 酵母双杂交法216

一、酵母双杂交系统的基本原理和用途216

二、酵母双杂交的主要实验步骤218

三、酵母双杂交系统中常见问题与解决方案221

四、逆双杂交系统和三杂交技术222

第二节 标签融合蛋白结合实验223

一、标签融合蛋白结合实验基本步骤224

二、标签融合蛋白结合实验常见问题的解决与改进224

第三节 免疫共沉淀分析225

一、基本原理和主要步骤225

二、几种特殊的免疫共沉淀技术226

三、免疫共沉淀常见问题及解决办法227

第四节 物理学方法研究蛋白-蛋白相互作用228

一、荧光共振能量转移技术229

二、共振光散射技术和表面等离子共振技术231

三、共定位荧光染色技术233

第五节 蛋白-蛋白相互作用预测方法236

第十三章 蛋白质组学研究相关技术238

第一节 蛋白质组双向凝胶电泳-质谱研究技术239

一、双向凝胶电泳239

二、MALD I-TOF质谱鉴定蛋白质241

第二节基于多维层析-质谱的蛋白质组研究策略244

一、蛋白质样本制备与酶解245

二、肽混合物层析分离245

三、电喷雾串联质谱246

四、多维层析分离技术的新进展248

第三节 定量蛋白质组学研究技术248

一、荧光双向差异凝胶电泳248

二、细胞培养氨基酸代谢稳定核素标记技术249

三、核素辅助多重化学标记技术250

四、无标记定量技术251

五、质谱多反应监测绝对定量技术251

第十四章 基因表达谱分析254

第一节 基因表达谱分析的基本方法254

一、基因芯片技术254

二、基因表达系列分析255

三、基因测序技术256

第二节基因芯片的原理及应用257

一、基因芯片的工作原理257

二、基因芯片技术的基本流程257

三、基因芯片的应用261

第三节基因芯片的数据挖掘262

一、生物信息学数据库263

二、基因芯片数据挖掘的常用方法264

第四节蛋白质芯片的原理及应用265

一、蛋白质芯片的原理和实验流程266

二、蛋白质芯片的分类及应用267

第十五章 基因转录调控分析269

第一节转录调节蛋白与DNA的结合分析269

一、凝胶迁移或电泳迁移率实验269

二、染色质免疫沉淀技术272

第二节 启动子转录活性分析275

一、报告基因技术的原理和应用275

二、常用的报告基因275

三、主要操作步骤277

第三节DNA甲基化分析278

一、甲基化特异性PCR279

二、亚硫酸盐修饰后基因组测序281

三、DNA甲基化检测的其他方法282

第四节 芯片技术在基因表达调控研究中的应用283

一、染色质免疫共沉淀-芯片技术283

二、染色质免疫共沉淀-序列分析技术284

第十六章 非编码RNA研究策略与方法285

第一节miRNA的研究策略及相关技术285

一、miRNA的发现与克隆286

二、miRNA定量检测方法及其选择286

三、miRNA靶基因的预测与证实290

四、miRNA功能研究292

第二节siRNA的设计与应用295

一、应用siRNA的目的与原理295

二、siRNA的设计与合成296

三、siRNA的体内外递送方式297

第十七章 疾病相关基因的鉴定和分析299

第一节 鉴定和分析疾病相关基因的策略299

一、疾病相关基因鉴定的基本原则299

二、DNA标记299

三、连锁分析299

四、关联分析300

五、动物模型300

第二节 基因分型301

一、SNP分型302

二、STR分型303

三、拷贝数目差异分型304

第三节 突变基因的检测306

一、以PCR为基础的检测方法306

二、以核酸杂交为基础的检测方法306

第十八章 遗传修饰动物309

第一节 小鼠实验的一般要求309

一、小鼠实验室的建立309

二、小鼠的基本饲养条件310

三、小鼠的日常管理310

第二节 转基因小鼠310

一、转基因载体的构建311

二、受精卵的显微注射和移植312

三、转基因小鼠的鉴定和进一步培育316

四、转基因小鼠的表型分析317

第三节 基因剔除小鼠317

一、基因剔除载体的设计和构建318

二、ES细胞的培养和在ES细胞进行基因剔除320

三、ES细胞注射入囊胚和囊胚的移植324

四、基因剔除小鼠的基因型和表型分析325

第十九章 基因功能的研究策略327

第一节 从分子水平研究基因产物的功能特点327

一、应用计算机分析预测蛋白质功能327

二、通过细胞内定位分析基因表达产物的可能功能328

三、基因表达的定性、定量分析328

四、通过定点突变分析蛋白质的功能329

五、确定相互作用分子330

第二节 从细胞水平研究基因产物的作用机制330

一、表达、纯化基因产物330

二、在细胞内转染表达基因以研究基因的功能331

三、通过降低基因的表达水平分析基因表达产物在细胞中的作用331

四、通过下游分子验证基因表达产物的功能332

第三节 从整体水平研究基因产物的生物学效应333

一、基因表达产物的体内分布特征333

二、基因在生理或病理过程中的表达分析333

三、基因敲除与敲入333

四、体内表达基因334

附录335

附录Ⅰ分子生物学实验设计中的常见错误335

附录Ⅱ分子生物学实验微量操作技巧339

附录Ⅲ分子生物学实验教学实施方案343

实验BCA法测定蛋白质的含量343

实验二 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳344

实验三 血清清蛋白、Y-球蛋白的分离纯化345

实验四 组织DNA与RNA的分离与提取348

实验五 碱裂解法提取质粒 DNA349

实验六 紫外分光光度法测定核酸含量350

实验七 聚合酶链反应350

实验八DNA重组351

实验九 蛋白质印迹353

附录Ⅳ分子生物学实验资料参考356

英中文名词对照索引375