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目录1

第一章　显微技术1

第一节 显微观察1

一、相差显微镜1

【实验1-1】相差显微镜的使用2

二、荧光显微镜5

【实验1-2】荧光显微镜的使用8

三、电子显微镜8

【实验1-3】细菌、酵母菌超薄切片的透射电镜观察12

【实验1-4】噬菌体的透射电镜观察14

【实验1-5】质粒DNA的透射电镜观察15

【实验1-6】酵母细胞的扫描电镜观察18

第二节 显微摄影20

【实验1-7】显微摄影、菌落摄影和凝胶摄影21

第三节 放射自显影25

【实验1-8】硝酸纤维素滤纸上标记DNA的放射自显影25

第四节 显微操作技术用于单细胞分离27

【实验1-9】显微操纵仪用于单细胞分离29

【实验1-10】显微操纵仪用于酵母子囊的解剖及子囊孢子单孢化30

【实验1-11】玻璃微型工具的制作31

第二章　微生物细胞特殊结构的观察33

第一节 染色技术33

一、染色的基本原理33

二、染料34

三、染色36

【实验2-1】真菌的荧光染色与观察36

第二节 细胞主要结构成分的分离与观察38

【实验2-2】革兰阳性细菌细胞壁的制备39

【实验2-3】酵母细胞壁甘露聚糖的制备41

【实验2-4】细胞壁的形态观察42

【实验2-5】革兰阴性菌细胞外膜蛋白的分离43

【实验2-6】细菌荚膜的观察44

【实验2-7】细菌鞭毛的观察45

【实验2-8】微生物细胞核的观察47

【实验2-9】细菌染色体DNA的分离与观察49

【实验2-10】异染颗粒的观察51

【实验2-11】酵母细胞内脂肪颗粒和肝糖颗粒的观察52

【实验2-12】酵母液泡及线粒体的提取54

一、芽孢57

第三节 芽孢、子囊孢子和假菌丝的观察57

【实验2-13】细菌芽孢形成及发芽的观察59

【实验2-14】伴孢晶体的观察60

二、酵母子囊孢子61

【实验2-15】酵母子囊孢子的形成及观察63

【实验2-16】酵母单倍体的分离与鉴定64

三、酵母假菌丝66

【实验2-17】酵母假菌丝的观察66

第三章　噬菌体69

【实验3-1】噬菌体的分离与纯化72

【实验3-2】高效价噬菌体原液的制备74

【实验3-3】溶源菌的鉴定75

【实验3-4】抗噬菌体产α-淀粉酶菌株的选育77

第四章　标记菌种的获得与应用79

第一节 富集培养技术在获得标记菌种中的应用79

一、营养缺陷型富集法在原核细胞中的应用79

二、营养缺陷型富集法在真核细胞中的应用81

三、浓度梯度法富集抗性突变株82

四、富集法在研究次级代谢的重组DNA技术中的应用84

第二节 营养缺陷型标记菌种的获得84

三、检出缺陷型85

一、诱变方法85

二、淘汰野生型85

四、营养缺陷型生长谱的确定87

【实验4-1】芽孢杆菌营养缺陷型的筛选89

【实验4-2】酵母营养缺陷型的筛选91

【实验4-3】青霉菌营养缺陷型菌株的筛选92

第三节 呼吸缺陷型标记菌种的获得94

【实验4-4】酵母呼吸缺陷型的筛选94

第四节 抗反馈调节抗性突变株的获得与应用95

【实验4-5】氨基酸抗反馈调节突变株的选育98

第一节 工业菌种育种的策略101

第五章　原生质体系列育种技术101

第二节 原生质体融合育种102

一、原生质体融合育种的特点103

二、原生质体融合育种步骤与要点107

三、原生质体再生率和融合率的计算115

【实验5-1】芽孢杆菌的原生质体融合115

【实验5-2】链霉菌原生质体融合119

【实验5-3】小单胞菌的原生质体融合124

【实验5-4】酿酒酵母的原生质体融合125

【实验5-5】丝状真菌的原生质体融合128

第三节 原生质体转化育种134

【实验5-6】芽孢杆菌原生质体转化134

【实验5-7】质粒DNA转化链霉菌原生质体137

【实验5-8】酿酒酵母的原生质体转化法138

【实验5-9】真菌原生质体转化139

第四节 原生质体诱变育种141

【实验5-10】芽孢杆菌种间融合子F-26-2原生质体诱变育种142

【实验5-11】紫外线诱变原生质体选育L-谷氨酸高产菌143

一、紫外线照射原生质体增加融合率145

第五节 原生质体技术中的一些特殊技术145

二、供体原生质体的热灭活146

三、原生质体电融合技术147

【实验5-12】电诱导酵母原生质体融合147

四、遗传转移148

【实验5-13】原生质体融合法转移酵母线粒体及杀伤质粒148

第六章　基因工程育种技术151

第一节 基因工程的基本过程和原理151

一、载体152

二、DNA重组用酶154

三、宿主细胞155

四、外源DNA156

第二节 大肠杆菌基因工程160

一、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化160

【实验6-1】用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌（Ⅰ）161

【实验6-2】用氯化钙制备感受态大肠杆菌（Ⅱ）162

【实验6-3】用PEG制备和转化大肠杆菌感受态细胞163

【实验6-4】大肠杆菌的电击转化164

二、大肠杆菌中质粒的提取与纯化166

【实验6-5】质粒的大量提取与纯化166

【实验6-6】质粒的小量提取168

【实验6-7】用硅胶膜分离法小量提取质粒169

三、微生物染色体DNA的提取与PCR扩增170

【实验6-8】枯草杆菌染色体DNA的提取170

【实验6-9】真菌染色体DNA的简易提取方法171

【实验6-10】枯草杆菌淀粉酶基因的PCR扩增173

【实验6-11】从电泳凝胶中分离枯草杆菌淀粉酶基因174

四、外源基因在大肠杆菌中的高表达175

【实验6-12】载体和基因的酶切180

【实验6-13】基因与载体的连接180

第三节 非大肠杆菌微生物基因工程184

一、芽孢杆菌基因工程185

【实验6-14】枯草杆菌感受态细胞的制备和转化186

【实验6-15】地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化187

【实验6-16】枯草杆菌转化子质粒的提取和检测188

【实验6-17】高碱性蛋白酶基因多拷贝重组菌的构建190

二、酵母基因工程194

【实验6-18】酵母染色体DNA的提取196

【实验6-19】酿酒酵母的乙酸锂完整细胞转化法197

【实验6-20】单链载体DNA的制备198

【实验6-21】酵母菌质粒DNA的提取199

【实验6-22】巴斯德毕赤酵母的电转化方法200

【实验6-23】羟酸还原异构酶基因多拷贝重组啤酒酵母的构建201

第七章　微生物细胞固定化方法205

第一节 载体结合法206

一、表面吸附法206

二、共价结合法207

第二节 交联法208

第三节 包埋法208

一、海藻酸钙凝胶包埋法209

【实验7-1】酿酒酵母的海藻酸钙固定化211

【实验7-2】固定化枯草杆菌连续生产耐热α-淀粉酶213

二、κ-角叉胶包埋法215

【实验7-3】κ-角叉胶一步包埋法215

【实验7-4】κ-角叉胶二步包埋法217

【实验7-5】固定化酵母连续生产酒精218

【实验7-6】固定化细胞的回收与活细胞计数219

三、聚丙烯酰胺凝胶包埋法219

【实验7-7】大肠杆菌的聚丙烯酰胺凝胶固定化220

四、光交联树脂前聚体包埋法221

【实验7-8】光交联树脂固定化原生质体221

五、其他载体包埋方法222

第四节 几种固定化细胞方法联用224

一、包埋-交联法224

二、吸附-交联法225

三、包埋-吸附法225

第五节 其他固定化方法225

第六节 固定化微生物细胞方法的选择226

一、固定化微生物细胞方法的选择226

二、固定化细胞技术的评价指标227

第七节 微生物细胞固定化技术前景展望227

主要参考文献229