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1.1 引言1

1.2 缓冲液1

1.2.1 缓冲液的性质1

第一章 蛋白质分离的准备1

1.2.2 缓冲液配制4

1.2.3 浓度对缓冲液pH值的影响5

1.2.4 某些缓冲液使用时的注意事项6

1.2.5 防止缓冲液受污染7

1.2.6 水的纯度7

1.3 盐,金属离子和鳌合剂7

1.3.1 离子强度7

1.3.2 二阶阳离子7

1.4.1 总则8

1.4.2 特殊情况8

1.3.3 鳌合剂8

1.4 还原剂8

1.5 去垢剂9

1.5.1 去垢剂的分类9

5.1.10 安全注意事项10

1.5.2 蛋白质溶解的初始操作步骤13

1.6 蛋白质的环境因素14

1.6.1 表面效应14

1.6.2 温度14

1.6.3 储存15

1.7 蛋白酶抑制剂16

1.7.1 常用抑制剂16

10.1 蛋白质纯化18

1.7.2 蛋白酶抑制剂混合使用18

2.1 引言20

第二章 蛋白质的提取和溶解20

2.2 细胞破碎和蛋白溶解21

2.2.1 匀浆21

2.2.2 超声23

2.2.3 高压匀浆25

2.2.4 研磨25

2.2.5 (高速)珠磨27

2.2.6 酶溶27

2.2.7 化学渗透28

2.2.8 其他方法29

2.3 包涵体蛋白质的溶解29

2.3.1 包涵体蛋白质的溶解及复性30

2.3.2 防止包涵体形成33

3.1 280纳米(A280)光吸收法38

3.1.1 提要38

第三章 蛋白质浓度测定38

3.1.3 试剂39

3.1.4 操作步骤39

3.1.5 注意事项39

3.1.2 设备39

3.2 Bradford检测法42

3.2.1 提要42

3.2.2 设备43

3.2.3 试剂43

3.2.4 操作步骤43

3.2.5 注意事项46

3.3 Lowry检测法47

3.3.1 提要47

3.3.3 试剂48

3.3.2 设备48

3.3.4 操作步骤49

3.3.5 注意事项50

3.4 二喹啉甲酸(BCA)检测法51

3.4.1 提要51

3.4.2 设备52

3.4.3 试剂52

3.4.4 操作步骤52

3.4.5 注意事项54

3.5 斑点滤膜结合法54

3.5.1 概述54

3.5.2 操作步骤54

3.6 干扰物质表55

4.1 分析方法60

4.1.1 二氯醋酸沉淀法60

第四章 蛋白质溶液的浓缩60

4.1.2 丙酮沉淀法61

4.1.3 免疫沉淀法62

4.2.1 硫酸铵沉淀法65

4.2 制备方法65

4.2.2 有机溶剂沉淀法68

4.2.3 聚乙二醇沉淀法69

4.2.4 超滤法70

4.2.5 透析法72

4.2.6 离子交换层析和冷浆干燥法简述74

第五章 变性条件下的凝胶电泳77

5.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳77

5.1.1 原理77

5.1.3 制胶79

5.1.2 设备79

5.1.4 制备样品和上样87

5.1.5 电泳89

5.1.6 考马斯亮蓝染色90

5.1.7 银染争92

5.1.8 干胶97

5.1.9 讨论98

5.2.3 凝胶的制备101

5.2.1 引言101

5.2 梯度胶101

5.2.2 仪器101

5.3 SDS-尿素胶103

5.3.1 引言103

5.3.2 制胶104

5.4.2 分子量的测定105

5.4 其他方法105

5.4.1 放射性标记样品的检测105

5.4.3 蛋白质定量107

5.4.4 电泳后蛋白的洗脱108

第六章 非变性条件下的凝胶电泳111

6.1 引言111

6.2 不连续非变性凝胶电泳112

6.2.1 设备112

6.2.2 制胶112

6.2.3 样品制备117

6.2.4 电泳118

6.2.5 凝胶染色119

6.3.1 蛋白质分子量的测定120

6.3 相关的方法120

6.2.6 连续非变性凝胶电泳120

6.3.2 电泳后酶活性的测定122

第七章 等电聚焦和双向凝胶电泳124

7.1 等电聚焦124

7.1.1 原理124

7.1.2 主要仪器125

7.1.3 灌制等电聚焦凝胶125

7.1.4 样品制备和上样128

7.1.5 等电聚焦电泳129

7.1.6 聚焦后处理130

7.1.7 天然等电聚焦电泳的修正方案130

7.1.8 讨论131

7.2 固相pH梯度等电聚焦电泳134

7.2.1 简介134

7.2.2 仪器135

7.2.3 制备等电聚焦凝胶135

7.2.4 样品制备和上样138

7.2.5 等电聚焦电泳138

7.2.6 聚焦后处理139

7.2.7 讨论139

7.3 双向凝胶电泳140

7.3.1 简介140

7.3.2 仪器140

7.3.3 操作步骤141

7.3.4 讨论144

第八章 蛋白质的毛细管电泳分析148

8.1 引言148

8.2 影响分离效率的几个因素149

8.3.2 吸附涂层151

8.3 柱制备技术151

8.3.1 键合涂层151

8.5 毛细管电泳检测器152

8.4 不同分离条件的影响152

8.6 实验操作153

8.6.1 实验步骤153

8.6.2 操作条件选择153

8.6.3 毛细管区带电泳155

8.6.4 毛细管等电聚焦156

8.6.5 毛细管凝胶电泳159

8.6.6 亲和毛细管电泳160

8.7 应用实例161

8.7.1 聚丙烯酰胶涂层毛细管电泳柱的制备161

8.7.2 毛细管凝胶电泳分离蛋白质162

8.7.3 毛细管等电聚焦163

9.1 引言166

第九章 免疫印迹166

9.1.1 免疫印迹用膜167

9.1.2 将蛋白质固定在膜上的其他应用167

9.2 免疫印迹操作168

9.2.1 仪器168

9.2.2 试剂168

9.2.3 操作步骤169

9.2.4 其他检测方法的修正方案178

9.2.5 总蛋白质染色181

9.2.6 免疫印迹清除182

9.3.2 转移异常183

9.3.3 免疫印迹的其他应用183

9.3.1 膜的储存183

9.3 讨论183

第十章 离子交换层析189

10.1.1 引言189

10.1.2 方法197

10.2 蛋白质溶液的浓缩210

10.3 批量层析210

第十一章 凝胶过滤层析212

11.1 蛋白质的纯化212

11.1.1 引言212

11.1.2 方法219

11.2 更换蛋白质的缓冲液229

第十二章 亲和层析231

12.1 引言231

12.2 亲和柱的制备232

12.2.1 配基固相化技术234

12.2.2 非特异洗脱的策略236

12.3 特异分离技术238

12.3.1 抗体238

12.3.2 核酸246

12.3.3 凝集素250

12.3.4 染料配基254

12.3.5 固相化金属亲和层析257

12.3.6 疏水作用层析259

第十三章 蛋白质的晶体培养——悬滴结晶264

13.1 引言264

13.2 悬滴结晶法266

13.2.1 结晶原理266

13.2.2 第一阶段操作步骤269

13.3 设计最优结晶方案278

13.3.1 稀溶液基质的微调279

13.3.2 初始筛选的扩展284

13.3.3 蛋白质结晶的灵活性与困难284

第十四章 cDNA法推断蛋白质的一级结构287

14.1 引言287

14.2 一般策略287

14.2.1 蛋白质的纯化和肽段氨基酸序列分析287

14.2.2 引物的设计289

14.2.3 用PCR扩增目的cDNA片段291

14.2.4 cDNA的克隆及测序292

14.2.5 cDNA序列的分析及蛋白质一级结构的确定292

14.3 PK-120的纯化及肽段氨基酸序列分析294

14.3.1 仪器及材料294

14.3.2 PK-120的纯化295

14.3.3 分离纯化肽段及测定氨基酸序列296

14.4 部分分解多肽两端有关的PCR法筛选PK-120基因297

14.4.1 仪器及材料297

14.4.2 引物设计298

14.4.3 PCR扩增299

14.4.4 凝胶电泳及提取DNA299

14.4.5 测定碱基序列299

14.5 PK-120 cDNA克隆300

14.5.1 仪器及材料300

14.5.2 杂交反应300

14.5.3 cDNA推测PK-120一级结构的特征301

附录1 常用化学物质分子量304

附录2 一些蛋白质的分子量和等电点308

附录3 硫酸沉淀剂表310

附录4 分光光度曲线312