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第一章 核酸提取1

第一节 基因组DNA的制备1

一、制备植物细胞基因组DNA1

二、制备动物细胞基因组DNA3

三、制备细菌基因组DNA4

四、制备酵母基因组DNA（以Pichia pastoris基因组DNA提取为例）5

五、结果分析6

六、基因组DNA提取注意事项7

第二节 RNA的制备7

一、动物物RNA提取（以人脐带组织总RNA的抽提为例）7

二、植物RNA的分离8

三、绿色叶片植物叶线粒体RNA的分离12

四、酵母RNA分离14

五、酵母tRNA制备（苯酚法）15

六、细菌RNA分离16

七、结果分析17

第三节 质粒DNA制备17

一、大肠杆菌质粒DNA制备（碱裂解法）17

二、农杆菌质粒DNA提取19

三、结果分析24

第二章 cDNA文库构建27

第一节 应用常规方法构建cDNA文库27

一、原理27

二、cDNA第一条链的合成27

三、cDNA第二条链的合成30

四、补平cDNA链末端34

五、cDNA甲基化35

六、cDNA与接头或衔接子相连接37

七、凝胶过滤分离cDNA39

八、cDNA与λ噬菌体臂的连接40

九、重组子的筛选与鉴定43

第二节 构建cDNA文库新方法44

一、减数cDNA文库44

二、标准化cDNA文库45

第三节 cDNA文库构建及应用实例45

一、主要材料45

二、实验操作要点46

三、结果及分析47

第三章 已知目标DNA片段的获取51

第一节 PCR法扩增目标DNA片段51

一、原理51

二、PCR条件52

三、引物设计原则52

四、PCR反应特点53

五、试剂53

六、温度与时间的设置54

七、PCR扩增效果的检查55

八、注意事项55

九、用PCR扩增目标基因实例56

十、PCR技术扩展58

第二节 基因的化学合成69

一、磷酸二酯法69

二、磷酸三酯法71

三、固相亚磷酸三酯法71

四、用寡核苷酸片段组装72

第四章 已知部分序列的DNA片段的获取78

第一节 RACE78

一、5′RACE78

二、3′RACE84

三、RACE方案的PCR优化86

四、RACE应用实例86

第二节 染色体步移87

一、原理88

二、材料89

三、实验操作90

第三节 反向PCR94

一、原理94

二、材料95

三、实验操作96

四、反向PCR应用实例97

第四节 锚定PCR98

一、原理98

二、以同聚物为锚定引物进行互补锚定PCR扩增已知基因侧翼序列98

三、用人工合成的特定序列为锚定引物扩增已知基因侧翼序列103

四、锚定应用实例104

第五章 未知DNA片段的获取108

第一节 应用PCR技术获取新基因108

一、应用简并PCR技术获取新基因108

二、应用限制性显示PCR（restriction display PCR,RD-PCR）技术获取新基因111

三、外显子捕获PCR（exon trapping PCR）获取新基因114

第二节 应用杂交技术获取新基因120

一、抑制差减杂交法120

二、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）技术127

第三节 应用差异显示技术获取新基因133

一、原理133

二、材料134

三、实验操作136

四、应用实例140

第四节 克隆新基因的其他技术141

第六章 RNAi技术147

第一节 概述147

一、定义147

二、RNAi的发现147

三、RNAi的作用的可能机制147

四、RNAi的作用特点148

五、RNAi的应用149

六、研究方法152

七、RNAi研究的一般技术路线152

第二节 RNAi实验技术155

一、siRNA序列的选择155

二、制备长dsRNA分子155

三、制备siRNA双链体159

四、细胞培养及24孔板细胞制备160

五、转染161

六、基因敲除结果分析170

七、RNAi应用实例171

第七章 DNA重组175

第一节 传统DNA重组技术175

一、分子克隆载体与宿主175

二、分子克隆常用的工具酶184

三、重组载体的构建190

四、重组DNA导入宿主细胞及其重组子的筛选197

第二节 重组工程221

一、细菌中的内源性重组系统（RecA重组系统）221

二、不依赖RecA的重组系统（来源于噬菌体的重组系统）221

三、单链DNA重组工程222

第八章 生产重组蛋白225

第一节 应用微生物细胞生产重组蛋白225

一、概述225

二、应用大肠杆菌生产重组蛋白235

三、应用Pichia pastoris生产重组蛋白251

第二节 应用植物生产重组蛋白259

一、概述259

二、植物细胞培养基本技术260

三、在生物反应器中培养植物细胞284

四、应用植物表达外源蛋白应用实例288

第三节 应用动物细胞生产重组蛋白288

一、概述288

二、动物细胞及组织基本培养技术295

三、动物细胞发酵工艺298

四、应用动物细胞生产重组蛋白实例303

第九章 纯化技术307

第一节 材料的选择与处理307

一、材料的选择、样品的保存与发酵液的预处理307

二、细胞的破碎307

第二节 抽提、萃取与浓缩308

一、抽提目标成分308

二、萃取311

三、浓缩技术311

第三节 层析320

一、吸附层析（absorption chromatography）320

二、分配层析（partition chromatography）320

三、离子交换层析（ion-exchange chromatography）321

四、凝胶过滤层析332

五、亲和层析336

第四节 纯化技术应用实例339

一、Pichia pastoris分泌重组蛋白的纯化（以纯化重组angiostatin为例）339

二、大肠杆菌中表达产物（包涵体）的纯化（以纯化重组careticulin-N58为例）340

第十章 电泳技术346

第一节 概述346

一、电泳技术原理346

二、影响电泳迁移率的因素346

三、电泳技术的分类347

第二节 醋酸纤维素薄膜电泳347

一、材料347

二、实验操作348

三、应用349

第三节 琼脂糖凝胶电泳349

一、原理349

二、特点350

三、材料350

四、实验操作350

五、应用351

第四节 SDS-PAGE351

一、原理351

二、材料352

三、实验操作354

第五节 双向电泳359

一、原理359

二、实验操作359

第六节 毛细管电泳369

一、概述369

二、原理369

三、分离模式370

四、毛细管电泳的应用371

五、应用实例372

第十一章 杂交技术375

第一节 核酸分子杂交375

一、原理375

二、常用探针的种类及其制备375

三、杂交385

第二节 蛋白印迹（Western Blot）398

一、原理398

二、材料399

三、实验操作400

第十二章 生物质谱技术404

第一节 生物质谱（biological mass spectrometry）的特点与应用404

一、生物质谱的特点404

二、生物质谱的应用404

第二节 生物质谱基本技术407

一、质谱仪的主要元件407

二、生物质谱工作基本原理408

三、生物质谱基本方法（举例）410

四、色谱-质谱联机412

第十三章 生物芯片417

第一节 概述417

一、生物芯片技术的形成417

二、生物芯片的分类417

第二节 生物芯片的操作原理及其操作程序419

一、操作原理419

二、操作程序420

第三节 生物芯片具体操作方法及应用430

一、生物芯片具体操作方法430

二、生物芯片应用概述433

三、生物芯片应用实例436

第四节 生物芯片技术的难点与展望438

第十四章 噬菌体展示技术443

第一节 概述443

一、原理443

二、用于噬菌体展示的表达载体443

三、噬菌体显示与筛选技术443

四、应用444

第二节 噬菌体展示实验技术应用实例（用噬菌体展示技术筛选CCR5亲和短肽）445

一、材料445

二、实验操作447

三、结果与分析450

第十五章 生命大分子相互作用分析461

第一节 酵母单杂交461

一、原理462

二、材料462

三、实验操作464

第二节 酵母双杂交470

一、原理470

二、材料471

三、实验操作474

第三节 酵母三杂交系统482

一、原理482

二、酵母三杂交系统的应用482

三、常用载体和菌株483

四、基本实验操作举例483

第四节 DNase Ⅰ足迹法研究DNA蛋白质相互作用487

一、原理487

二、材料487

三、实验操作488

第十六章 生物信息学概况及生物信息数据库491

第一节 生物信息学概况491

一、生物信息学的产生和发展491

二、生物信息学的研究内容491

第二节 生物信息数据库493

一、核酸数据库493

二、蛋白质数据库495

三、其他数据库资源498

第三节 生物信息学应用实例508

一、生物信息学在作物抗性研究中的应用508

二、生物信息学与人类基因组计划510