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第一部分基因工程原理1

第一章 绪论1

1.1基因工程的发展史1

1.1.1理论上三个重要的发现1

1.1.2技术上三个重要的成果2

1.2基因工程的研究内容3

1.2.1基因工程3

1.2.2基因工程的研究内容4

1.3基因工程的应用5

1.3.1在医药业的应用5

1.3.2在农业方面的应用8

1.3.3在畜牧业方面的应用9

思考题10

第二章 基因工程的基本操作程序11

2.1带有目的基因的DNA片段的制备11

2.1.1从已有的生物基因组中分离11

2.1.2人工合成法13

2.2 DNA片段与载体DNA体外重组15

2.2.1 DNA分子的剪切15

2.2.2 DNA分子的连接15

2.2.3碱性磷酸酶的作用19

2.3 DNA重组体转入受体细胞20

2.3.1受体细胞20

2.3.2 DNA重组体转入受体细胞23

2.4.2菌落或噬菌斑原位杂交24

2.4.1表型直接筛选法24

2.4重组体克隆的筛选与鉴定24

2.5外源基因的表达25

2.5.1启动子25

2.5.2核糖体结合位点27

2.5.3真核基因在大肠杆菌体系中的表达28

思考题29

第三章 基因工程的工具酶30

3.1引言30

3.2剪切酶31

3.2.1限制性核酸内切酶31

3.2.2核酸外切酶37

3.2.3 DNA酶38

3.3.2甲基化酶39

3.3修饰酶39

3.3.1磷酸酶39

3.3.3聚合酶40

3.4连接酶43

3.4.1连接反应43

3.4.2连接酶43

思考题44

第四章 基因工程的载体45

4.1质粒46

4.1.1一般生物学性状46

4.1.2作为载体的特性47

4.1.3两种常用的质粒49

4.1.4利用质粒进行克隆54

4.2噬菌体λ56

4.2.1一般生物学特性56

4.2.2利用噬菌体λ进行克隆59

4.2.3 λZAP64

4.3单链噬菌体（M13系列）65

4.3.1一般生物学特性65

4.3.2丝状噬菌体载体及M13载体67

4.3.3噬菌体展示系统70

4.4粘粒72

思考题73

第五章 基因文库的构建74

5.1.1原理75

5.1基因组文库75

5.1.2构建的程序77

5.2 cDNA文库82

5.2.1原理82

5.2.2构建的程序82

5.3特殊序列文库85

5.4酵母人工染色体87

思考题89

第六章 聚合酶链反应90

6.1基本原理90

6.1.1反应过程91

6.1.2反应物主要成分93

6.1.3基本操作95

6.2.1反向PCR96

6.2PCR的种类96

6.2.2跳跃PCR97

6.2.3锚式PCR98

6.3应用PCR时的注意事项99

6.3.1引物的设计99

6.3.2实验操作101

6.3.3避免序列的错误扩增101

6.3.4污染问题102

6.4 PCR的应用102

6.4.1在医学方面的应用102

6.4.2在基础研究方面的应用104

思考题105

7.1.1人类基因组计划的由来106

第七章 人类基因组计划106

7.1人类基因组计划的概述106

7.1.2人类基因组计划的目标107

7.1.3人类基因组研究的应用108

7.2人类基因组研究的主要内容113

7.2.1建立遗传图谱113

7.2.2建立物理图谱114

7.2.3DNA序列测定115

7.2.4基因的确定和分析115

7.3人类基因组研究的策略116

7.3.1人类基因组研究的基本思路116

7.3.2确定特定的基因118

7.3.3利用染色体特征研究人类基因组120

7.4.1伦理和社会学方面122

7.4人类基因组研究引发的社会和伦理问题122

7.4.2商业与法律方面124

7.5人类基因组计划的研究现状与展望125

7.5.1研究现状125

7.5.2展望127

思考题133

第八章 基因工程的安全防护134

8.1生物公害134

8.2生物公害的控制135

8.2.1实验人员适应性训练135

8.2.2生物防护136

8.2.4重组体的保管137

8.2.3物理防护137

8.3植物基因工程的潜在危害和防护138

8.4中国的《基因工程安全管理办法》138

8.4.1适用范围139

8.4.2管理体系139

思考题140

第二部分基因工程常用技术143

第九章 质粒DNA的提取与纯化143

9.1概论143

9.1.1细菌培养物的培养143

9.1.2细菌的收获和裂解144

9.1.3质粒DNA的提取和纯化145

9.2.1细菌的收获146

9.2质粒DNA的小量制备146

9.2.2细菌的裂解147

9.3质粒DNA的大量制备150

9.3.1在丰富培养基中扩增质粒150

9.3.2细菌的收获151

9.3.3细菌的裂解151

9.4质粒DNA的纯化155

9.4.1聚乙二醇沉淀法155

9.4.2氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法157

9.4.3纯化后的处理159

第十章 DNA凝胶电泳技术165

10.1琼脂糖凝胶电泳166

10.1.1概论166

10.1.2琼脂糖凝胶的制备及检测171

10.1.3 DNA的回收与纯化177

10.2聚丙烯酰胺凝胶电泳185

10.2.1概论185

10.2.2非变性聚丙烯酰胺凝胶187

10.3其他类型的凝胶电泳195

10.3.1链分离凝胶电泳195

10.3.2变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳196

10.3.3脉冲电场凝胶电泳196

第十一章 RNA分析的主要方法198

11.1 RNA分析概述198

11.2 Northern杂交简介199

11.3.1经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳201

11.3 RNA电泳201

11.3.2在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳203

11.4转膜205

11.4.1变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜205

11.4.2变性RNA转移至尼龙膜209

11.5转膜前后的RNA染色210

11.5.1方法Ⅰ210

11.5.2方法Ⅱ210

11.6杂交和放射自显影211

第十二章 Southern杂交213

12.1概述213

12.2基因组DNA的分离214

12.3.1转移的方法215

12.3将DNA从凝胶转至固相支持体上215

12.3.2 DNA转移至硝酸纤维素滤膜218

12.3.3 DNA从凝胶转移至尼龙膜221

12.4探针与固定化的核酸杂交223

12.4.1探针与固定于膜上的DNA杂交224

12.4.2放射性标记的寡核苷酸与基因组DNA杂交229

12.4.3从杂交膜上除去放射性标记的探针231

第十三章 Western印迹法233

13.1概述233

13.2蛋白样品的制备和电泳235

13.2.1裂解哺乳动物细胞和组织235

13.2.2电泳237

13.3将蛋白质从凝胶转移至固相支持体238

13.4对固定化的蛋白质进行染色241

13.5封闭杂交膜上的免疫球蛋白结合位点243

13.6抗体和靶蛋白的结合244

13.6.1第一抗体与硝酸纤维素滤膜共温育的方法244

13.6.2二级免疫试剂与硝酸纤维素滤膜共温育的方法245

13.6.3酶联抗体生色底物的使用247

第十四章 DNA序列测定250

14.1概述250

14.1.1Sanger双脱氧链终止法251

14.1.2 Maxam-Gilbert DNA化学降解法255

14.2随机测序256

14.2.1靶DNA的纯化和连接258

14.2.2靶DNA的断裂260

14.2.3 DNA的修补及大小选择262

14.2.4载体DNA的制备263

14.2.5靶DNA片段与载体DNA连接264

14.3定向测序265

14.3.1生成若干套嵌套的缺失突变体265

14.3.2利用外切核酸酶Ⅲ生成嵌套的缺失突变体268

14.4 Sanger双脱氧链终止法测序271

14.4.1准备271

14.4.2配制凝胶274

14.4.3加样及电泳277

14.4.4测序凝胶的放射自显影278

14.4.5从凝胶上读取DNA序列279

参考文献281