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理论部分3

1 绪论3

1.1 生物化学实验技术发展简史3

目录3

1.2 实验室规则6

1.3 实验室安全及防护知识7

1.3.1 着火7

1.3.2 爆炸8

1.3.3 中毒8

1.3.4 外伤9

1.3.5 触电9

1.4 实验记录与实验报告10

1.4.1 实验记录10

1.4.2 实验报告10

1.5.1 玻璃仪器的清洗11

1.5 实验室基本操作11

1.5.2 塑料器皿的清洗12

1.5.3 洗液的配制12

1.5.4 其他洗涤液12

1.5.5 玻璃和塑料器皿的干燥12

1.5.6 移液13

1.6 缓冲溶液与pH值测定16

1.6.1 基本概念16

1.6.2 生物化学常用缓冲液18

1.6.3 pH值的测定19

1.7 生物化学实验室的基本设施与装备22

1.7.1 温度与环境设施22

1.7.2 实验室用纯水22

1.7.7 层析装置23

1.7.6 电泳装置23

1.7.3 消毒系统23

1.7.4 计量系统23

1.7.5 离心设备23

1.7.8 光密度仪24

1.7.9 真空印迹系统24

1.7.10 核酸自动合成仪与测序仪24

1.7.11 蛋白质的自动合成与测序仪24

1.7.12 PCR仪24

1.7.13 核素实验设施24

1.7.14 生物培养设施24

1.7.17 暗室25

1.7.18 冷室25

1.7.19 其他设备25

1.7.16 高效液相色谱仪和毛细管电泳仪25

1.7.15 基因导入仪25

思考题26

2 生物大分子的制备27

2.1 概述27

2.2 生物大分子制备的前处理28

2.2.1 生物材料的选择28

2.2.2 细胞的破碎29

2.2.3 生物大分子的提取30

2.3 生物大分子的分离纯化32

2.3.1 沉淀法32

2.3.2 透析37

2.3.3 超滤38

2.3.4 冰冻干燥40

2.3.5 样品的保存41

2.3.6 分离纯化方法的选择43

思考题44

3 层析技术45

3.1 层析技术概述45

3.1.1 引言45

3.1.2 层析的基本理论45

3.1.3 层析的基本概念46

3.1.4 层析法的分类50

3.1.5 柱层析的基本装置及基本操作51

3.2 凝胶层析54

3.2.1 简介54

3.2.2 凝胶层析的基本原理54

3.2.3 凝胶层析的基本概念54

3.2.4 凝胶的种类和性质57

3.2.5 凝胶的选择、处理和保存59

3.2.6 凝胶层析的基本操作60

3.2.7 凝胶层析的应用62

3.3 离子交换层析63

3.3.1 简介63

3.3.2 基本原理63

3.3.3 离子交换剂的种类和性质64

3.3.4 离子交换剂的选择、处理和保存66

3.3.5 离子交换层析的基本操作67

3.3.6 离子交换层析的应用68

3.4 亲和层析69

3.4.1 简介69

3.4.2 亲和层析的基本原理69

3.4.3 亲和吸附剂70

3.4.4 亲和层析的基本操作75

3.4.5 亲和层析的应用76

思考题79

4 电泳技术80

4.1 电泳技术发展简史80

4.2 电泳的基本原理80

4.3 影响电泳分离的主要因素82

4.4 电泳的分类83

4.5 纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳84

4.6 琼脂糖凝胶电泳85

4.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳86

4.8 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳88

4.9 梯度凝胶电泳91

4.10 等电聚焦91

4.11 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳93

4.12 蛋白质的检测、鉴定及回收93

4.13 蛋白质印迹94

4.14 毛细管电泳96

思考题99

5 离心技术100

5.1 基本原理100

5.2 离心机的主要构造和类型101

5.3 制备性超速离心的分离方法104

5.4 离心机操作的注意事项106

思考题106

6 分光光度技术107

6.1 基本原理107

6.2 分光光度计的组成和构造111

6.3 分光光度法在生物化学实验技术中的应用116

思考题116

7.1 免疫化学技术简介117

7.2 抗原的免疫原性和专一性117

7 免疫化学技术117

7.3 抗体的结构和功能118

7.4 抗原抗体的结合120

7.5 动物的常规免疫122

7.6 双向免疫扩散及免疫电泳123

7.7 酶联免疫吸附法125

思考题127

实验部分131

实验1 蛋白质含量测定法131

1．微量凯氏定氮法131

2．双缩脲法132

3．Folin－酚试剂法133

4．改良的简易Folin－酚试剂法136

5．考马斯亮蓝法136

6．紫外吸收法138

思考题140

实验2 凝胶层析法测定蛋白质分子质量142

1．实验目的142

2．实验原理142

3．器材与试剂143

4．实验操作143

思考题145

实验3 等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点146

1．实验目的146

2．实验原理146

3．仪器和用具147

4．试剂147

5．溶液配制148

6．操作步骤148

7．数据处理149

思考题150

实验4 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳151

1．SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制152

2．SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制153

3．用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色155

4．干胶156

5．测量并计算相对分子质量156

思考题157

实验5 小牛胸腺DNA的制备158

1．实验目的158

2．实验原理158

3．器材与试剂159

4．实验步骤159

思考题160

2．实验原理161

实验6 小牛胸腺DNA熔解温度的测量161

1．实验目的161

3．器材与试剂162

4．操作步骤162

思考题163

实验7 脱辅基血红蛋白的制备和重组164

1．实验目的164

2．实验原理164

3．实验方法164

思考题166

实验8 离子交换柱层析分离核苷酸167

1．实验目的167

2．实验原理167

3．试剂与器材170

4．操作步骤171

5．结果处理173

思考题174

实验9 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究175

1．蔗糖酶的提取与部分纯化176

2．离子交换柱层析纯化蔗糖酶177

3．蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定179

4．反应时间对产物形成的影响183

5．pH值对蔗糖酶活性的影响184

6．温度对酶活性的影响和反应活化能的测定185

7．底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定187

8．尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验189

9．棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验191

思考题193

2．实验原理194

1．实验目的194

实验10 猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定194

3．器材与试剂195

4．实验步骤195

5．注意事项197

思考题197

实验11 亲和层析纯化胰蛋白酶198

1．引言198

2．实验目的与要求198

3．基本原理198

4．试剂与器材199

5．实验操作步骤200

6．实验结果处理203

7．参考资料204

思考题205

1．实验原理206

实验12 兔肌肌酸激酶的分离纯化及部分性质的测定206

2．实验试剂207

3．实验步骤207

思考题211

实验13 免疫化学实验212

1．免疫血清的制备212

2．沉淀反应定量法213

3．双向免疫扩散法214

4．对流免疫电泳法215

5．微量免疫电泳法216

6．单向定量免疫电泳法（火箭电泳法）217

7．双向免疫电泳法（交叉免疫电泳法）219

8．酶联免疫吸附测定（ELISA）219

9．蛋白质印迹225

思考题227

实验14 “干实验”：微机模拟蛋白质纯化实验228

思考题230

附录231

1．722型分光光度计操作规程231

2．753型（53W）紫外／可见分光光度计操作规程231

3．美国UNICO7202B型可见分光光度计232

4．恒流泵操作规程232

5．自动部分收集器操作规程233

6．电导率仪使用说明233

7．日立高速冷冻离心机操作程序233

8．各种仪器的使用注意事项235

9．德国耶拿（蔡司）SPECORD-200和SPEKOL-1100使用说明238

SPECORD-200使用说明238

SPEKOL-1100使用说明245

参考文献247