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1 基因电子克隆与初步生物信息分析基础实践1

1.1 实践目的与知识背景1

1.1.1 实践目的1

1.1.2 生物信息数据库1

1.1.3 热休克蛋白902

1.2 实践材料与方法2

1.2.1 生物信息学数据库和软件2

1.2.2 人类HSP90-β基因的电子克隆步骤3

1.2.3 人类HSP90-β基因的核酸和蛋白质序列分析3

1.3 实践结果与分析3

1.3.1 EST数据库的检索结果3

1.3.2 人类HSP90-β基因电子克隆4

1.3.3 人类HSP90-β基因的核酸序列分析5

1.4 实践体会8

1.5 小结8

2 含有某蛋白结构域基因群生物信息学分析实践10

2.1 实践目的与知识背景10

2.1.1 实践目的10

2.1.2 基因本体论10

2.1.3 Blast2GO11

2.1.4 Reticulon结构域11

2.2 实践材料与方法12

2.2.1 序列获取12

2.2.2 系统进化树分析12

2.2.3 Blast2GO功能注释13

2.2.4 目的基因选取13

2.2.5 疏水性分析13

2.2.6 跨膜结构分析13

2.2.7 结构域功能分析14

2.2.8 二级结构预测14

2.2.9 三级结构预测14

2.3 实践结果与分析15

2.3.1 水稻中含有Reticulon结构域基因15

2.3.2 系统进化树16

2.3.3 Blast2GO功能注释结果与目的基因选取16

2.3.4 疏水性分析17

2.3.5 跨膜结构分析19

2.3.6 结构域分析结果20

2.3.7 二级结构分析结果21

2.3.8 三级结构预测结果22

2.4 实践体会23

2.4.1 Blast2GO23

2.4.2 进化树分析24

2.5 小结24

3 实时荧光PCR定量分析实践25

3.1 实践目的与知识背景25

3.1.1 实践目的25

3.1.2 水稻概述26

3.1.3 实时荧光定量PCR技术26

3.1.4 实时荧光定量PCR技术原理26

3.1.5 荧光定量PCR中两个重要的概念28

3.1.6 Ct值与起始模板的关系28

3.1.7 PCR熔解曲线29

3.1.8 管家基因的选择29

3.1.9 双标准曲线法原理29

3.1.10 本实践技术路线29

3.2 实践材料与方法30

3.2.1 主要仪器30

3.2.2 PCR引物制备30

3.2.3 cDNA模板的制备31

3.2.4 质粒构建32

3.2.5 其他试剂33

3.2.6 实时PCR扩增体系33

3.2.7 RQ-PCR扩增曲线条件34

3.2.8 RQ-PCR熔解曲线条件35

3.2.9 样本检测35

3.3 实践结果与分析36

3.3.1 RNA提取及电泳鉴定36

3.3.2 引物筛选结果36

3.3.3 Mg2＋优化39

3.3.4 双标准曲线的制作40

3.3.5 水稻基因LOC_Os01g45914时空表达情况42

3.4 实践体会46

3.4.1 实时定量PCR技术的优点46

3.4.2 降落PCR47

3.4.3 参照基因eEF-1α47

3.4.4 PCR反应体系条件优化48

3.4.5 结论50

3.4.6 展望50

3.5 小结50

4 实时荧光COLD-PCR检测点突变实践51

4.1 实践目的与知识背景51

4.1.1 实践目的51

4.1.2 白血病概述52

4.1.3 白血病发病机理53

4.1.4 白血病分子遗传学53

4.1.5 微小残留白血病及其检测54

4.1.6 基因突变的研究背景55

4.1.7 COLD-PCR技术57

4.1.8 COLD-PCR技术的应用59

4.1.9 其他PCR技术59

4.2 实践材料与方法61

4.2.1 实验仪器61

4.2.2 主要材料61

4.2.3 其他试剂62

4.2.4 染料法测定野生型、突变型熔点62

4.2.5 非COLD-PCR反应体系和反应程序的建立63

4.2.6 FAST-COLD-PCR反应体系和反应程序的建立64

4.2.7 灵敏度分析的模板准备65

4.3 实践结果与分析65

4.3.1 反应体系优化65

4.3.2 Mg2＋浓度的优化65

4.3.3 不对称比例优化66

4.3.4 探针浓度优化67

4.3.5 灵敏度考察68

4.3.6 COLD-PCR程序的建立与优化69

4.3.7 COLD-PCR程序初步优化70

4.3.8 COLD-PCR程序再次优化72

4.3.9 COLD-PCR稳定性重复实践74

4.3.10 COLD-PCR灵敏度77

4.4 实践体会77

4.4.1 COLD-PCR技术的优点77

4.4.2 利用探针熔解曲线来检测突变的优缺点78

4.4.3 结论80

4.4.4 展望80

4.5 小结80

5 抗体金标记检测试纸制备与鉴定实践81

5.1 实践目的与知识背景81

5.1.1 实践目的81

5.1.2 黄曲霉毒素81

5.1.3 胶体金免疫层析技术82

5.1.4 胶体金免疫层析技术的应用83

5.2 实践材料与方法84

5.2.1 实践材料84

5.2.2 实践仪器84

5.2.3 实践方法84

5.3 实践结果与分析86

5.3.1 胶体金的紫外扫描鉴定86

5.3.2 试纸条灵敏度、特异性及其检测范围87

5.3.3 油脂样品的检测88

5.3.4 假阳性、假阴性的测定88

5.3.5 免疫层析试纸条的重现性89

5.3.6 免疫层析试纸条的稳定性89

5.4 实践体会89

5.4.1 结论89

5.4.2 改进89

5.5 小结90

6 基因芯片技术基础实践91

6.1 实践目的与知识背景91

6.1.1 实践目的91

6.1.2 生物芯片简介91

6.1.3 基因芯片制作方法92

6.1.4 基因芯片改性技术简介92

6.1.5 聚乳酸材料简介94

6.1.6 显色方法简介94

6.2 实践材料与方法94

6.2.1 仪器94

6.2.2 试剂95

6.2.3 溶液配制96

6.2.4 聚乳酸片96

6.2.5 DNA片段97

6.2.6 实践方法97

6.3 实践结果与分析100

6.3.1 ARF8基因扩增产物电泳图100

6.3.2 PLA芯片硅烷化前后比较图100

6.3.3 PLA芯片结果示意图101

6.4 实践体会101

6.4.1 结论101

6.4.2 改进101

6.5 小结102

7 高效液相色谱—串联质谱实践103

7.1 实践目的与知识背景103

7.1.1 实践目的103

7.1.2 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂103

7.1.3 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂检测方法发展现状103

7.1.4 检测方法的选择与建立104

7.1.5 本章实践主要过程106

7.2 实践材料与方法107

7.2.1 实践材料107

7.2.2 实践试剂107

7.2.3 实践仪器107

7.2.4 农药标准溶液配制108

7.2.5 样品处理108

7.3 实践结果与分析108

7.3.1 标准溶液色谱108

7.3.2 检测方法的选择与建立109

7.3.3 定性筛查109

7.3.4 定量分析与方法科学性验证111

7.3.5 方法精确度和准确度111

7.3.6 实际样品的测定112

7.4 实践体会113

7.5 小结114

8 CRISPR/CAS载体构建与转染实践115

8.1 实践目的与知识背景115

8.1.1 实践目的115

8.1.2 CRISPR/CAS系统概述115

8.1.3 CRISPR/CAS系统的广泛分布和分类115

8.1.4 hCdc6基因与结肠癌的发生116

8.2 实践材料与方法117

8.2.1 实践材料117

8.2.2 实践方法117

8.3 实践结果与分析128

8.3.1 目的载体PKS-hCdc6-target-A（flag/3flag）的构建128

8.3.2 PKS-hCdc6-C-target-final-flag/3flag载体构建130

8.3.3 目的载体与辅助载体的共转染与新型细胞系的筛选131

8.4 实践体会132

8.4.1 CRISPR/CAS系统介导的免疫机理132

8.4.2 影响小提中量质粒纯度的因素133

8.4.3 影响质粒转染效率的因素134

8.4.4 影响细胞传代效率的因素134

8.4.5 结论135

8.4.6 展望135

8.5 小结135

参考文献137