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1 哺乳动物细胞转录调控入门1

引言和概述1

全基因组方法小结3

染色质和通用转录机器5

染色质结构和组织5

染色质修饰8

染色质重塑12

通用转录机器17

调控区的组织18

基础转录复合物的组装和起始25

调解因子28

TFIID和TAF29

活化和抑制31

基因活化31

转录起始期间的染色质修饰和重塑32

通用机器募集的一种模式34

聚合酶Ⅱ延伸的初始阶段35

聚合酶Ⅱ在基因内遭遇核小体37

转录的沉默或抑制39

结语45

参考文献46

2 初始策略性问题55

引言和概述55

实验策略56

新转录因子的表征方法56

分析新基因的调控60

专题2.1核连缀转录分析63

考虑达到明确目标所需的时间投入和资源64

确定项目目标65

评估分析的可行性66

启动对新基因的综合转录调控分析68

技术70

方案2.1核连缀分析70

参考文献77

3 转录起始位点的定位79

引言和概述79

实验策略82

初步考虑82

快速扩增cDNA末端（RACE）84

专题3.1帽子依赖性RACE程序85

引物延伸87

专题3.2引物延伸87

RNase保护法91

专题3.3 RNase保护92

S1核酸酶分析94

专题3.4核酸酶保护95

专题3.5内含子对起始位点定位结果解释的影响96

技术98

方案3.1引物延伸分析98

方案3.2RNase保护分析106

参考文献113

4 启动子分析的功能性分析方法116

引言和概述116

实验策略119

选择分析方法：各种分析方法的优缺点119

瞬时转染分析127

专题4.1常用的转染方法128

专题4.2萤光素酶报告基因分析130

专题4.3 CAT报告基因分析131

专题4.4 LacZ、SEAP和GFP报告基因分析法133

专题4.5瞬时转染细胞的分离134

通过染色体整合的稳定转染分析139

专题4.6有复制能力的载体141

技术147

哺乳动物细胞的常用转染方法147

方案4.1 3T3成纤维细胞的磷酸钙转染148

方案4.2淋巴细胞系的DEAE-葡聚糖转染150

方案4.3 RAW264.7巨噬细胞的电穿孔转染152

方案4.1～4.3的附加说明155

方案4.4萤光素酶分析156

方案4.5氯霉素乙酰转移酶分析158

方案4.6 β-半乳糖苷酶分析161

参考文献163

5 远程控制区的鉴定和分析169

引言和概述169

专题5.1 DNase I高敏感性分析173

实验策略176

DNase I高敏感性176

基质附着区的鉴定180

专题5.2鉴定MAR的方法180

鉴定远程控制区的功能性方法182

表征远程控制区的功能性分析方法187

参考文献191

6 鉴定控制区内的顺式作用DNA元件197

引言和概述197

实验策略199

通过综合性突变体分析鉴定控制元件199

综合性分析的策略200

来自综合性突变体分析与系统发生分析比较的深刻见解213

参考文献215

7 鉴定DNA结合蛋白及其基因217

引言和概述217

鉴定DNA结合蛋白的实验策略219

数据库方法219

用于粗制细胞裂解物的蛋白质-DNA相互作用分析方法的发展222

专题7.1假设EMSA结果229

克隆和鉴定编码DNA结合蛋白基因的实验策略236

专题7.2通过蛋白质纯化克隆237

通过蛋白质纯化和肽序列分析进行克隆239

其他克隆方法242

参考文献246

8 确认蛋白质-DNA相互作用的功能相关性249

引言和概述249

实验策略252

染色质免疫沉淀252

通过基因破坏或RNA干扰的功能缺失研究254

体外蛋白质-DNA复合物的丰度257

DNA结合蛋白和靶基因的相对表达模式258

蛋白质结合所需核苷酸和调控元件活性所需核苷酸之间的相关性260

DNA结合蛋白的过量表达对报告基因或内源基因的反式激活261

与相邻控制元件结合的蛋白质间的协作结合和协同效应262

基因组足迹模式和体外足迹模式的比较264

蛋白质-DNA相互作用的相对亲和力265

显性失活突变体267

体外转录策略270

改变特异性实验272

参考文献274

9 内源性控制区的体内分析279

引言和概述280

实验策略281

染色质免疫沉淀281

DamID283

DNase I和DMS基因组足迹285

专题9.1连接介导PCR286

高锰酸钾基因组足迹289

核小体存在和定位的Southern印迹分析289

专题9. 2通过MNase-Southern印迹分析进行核小体定位的低分辨率分析291

监测核小体存在和定位的LM-PCR、PCR及ChIP策略292

用于分析核小体重塑的体内方法的概述295

DNase I高敏感性监测核小体重塑295

用于监测核小体重塑的MNase方法296

限制性内切核酸酶可及性分析297

专题9.3限制性内切核酸酶可及性-LM-PCR分析300

染色质构象捕获303

DNA甲基化305

技术306

方案9.1 MNase-Southern印迹分析306

方案9.2 LM-PCR方法316

方案9.3染色质免疫沉淀333

参考文献340

10 鉴定和表征转录调控因子的结构域348

引言和概述349

实验策略：定义结构域349

功能结构域的鉴定349

专题10.1结构域的计算分析350

基本突变原理352

专题10.2表达系统352

专题10.3标签识别与检测的通用方法355

序列特异性调控因子的结构域359

分离序列特异性调控因子的DNA结合和激活／抑制结构域360

专题10.4 VP16激活结构域：个案研究363

专题10.5 GAL4：个案研究364

专题10.6 KRAB抑制结构域：个案研究366

细分DNA识别亚结构域和寡聚化亚结构域369

概念和策略：蛋白质-蛋白质相互作用370

共激活因子和共抑制因子的分离及克隆370

研究激活结构域与共激活因子相互作用的方法371

通过亲和层析研究激活／抑制结构域与其靶标之间的相互作用372

改变特异性遗传系统374

通用转录机器的结构-功能分析377

共激活因子的分析379

技术383

方案10.1 PCR介导的定点突变383

参考文献389

11 DNA的调控性转录因子结合398

引言和概述398

实验策略401

DNA-蛋白质相互作用的一般理论和实例401

专题11.1 Kd情况的例子413

DNA-蛋白质相互作用的分析及建模415

专题11.2 SAAB分析418

专题11.3 DNase I足迹和外切核酸酶足迹420

专题11.4用于小沟相互作用的化学探针423

启动子特异性多组分核蛋白复合物的分析432

技术439

方案11.1 DNase I足迹439

方案11.2羟自由基足迹448

方案11.3磷酸乙基化干扰分析452

方案11.4甲基化干扰分析455

方案11.5电泳迁移率变动分析461

方案11.6 32P末端标记DNA片段的准备465

参考文献470

12 体外转录和起始前复合物组装477

引言和概述478

实验策略481

提取物的制备481

转录分析484

专题12.1测定体外转录的方法485

分级分离的系统490

专题12.2纯化的转录因子493

基本起始前复合物的形成496

开放复合物的形成、起始和启动子逃脱508

活化复合物在启动子上的组装513

技术521

核提取物制备：概述521

方案12.1 Dignam和Roeder核提取物522

方案12.2使用HeLa细胞提取物和引物延伸的体外转录526

方案12.3使用HeLa细胞核提取物的无G序列盒体外转录533

共激活因子的纯化（方案12.4和方案12.5）537

方案12.4表位标记TFIID的纯化537

方案12.5从表达FLAG标记调解因子亚基的HeLa细胞系中纯化调解因子543

方案12.6固定化模板分析547

方案12.7 Pol II开放复合物的高锰酸钾探测556

方案12.8 DNA结合TFIID的镁-琼脂糖EMSA561

参考文献566

13 体外研究染色质动力学：染色质组装、重塑和转录588

引言和概述588

实验策略589

用于组装染色质的策略589

专题13.1DNA模板和重建方法对阵列内核小体定位的影响592

组蛋白来源595

染色质重建的生化表征598

专题13.2核小体阵列的MNase分析603

专题13.3核小体阵列的EcoRI酶切分析605

体外测验组蛋白修饰作用策略606

染色质重塑／修饰酶的分析610

以染色质模板进行体外转录619

技术621

方案13.1鸡红细胞组蛋白八聚体制备621

方案13.2核小体的盐梯度透析重建632

方案13.3利用重组的果蝇ACF和NAP1重建核小体阵列637

参考文献650

附录：注意事项659

索引668